Ďakujeme, že ste navštívili Nature.com.Verzia prehliadača, ktorú používate, má obmedzenú podporu CSS.Pre najlepší zážitok vám odporúčame použiť aktualizovaný prehliadač (alebo vypnúť režim kompatibility v programe Internet Explorer).Medzitým, aby sme zabezpečili nepretržitú podporu, vykreslíme stránku bez štýlov a JavaScriptu.
Toxoplasma gondii je intracelulárny protozoálny parazit, ktorý moduluje mikroprostredie infikovaného hostiteľa a je známe, že je spojený s výskytom rastu mozgového nádoru.V tejto štúdii predpokladáme, že exozomálna miRNA-21 z infekcie Toxoplasma podporuje rast mozgového nádoru.Boli charakterizované exozómy z mikroglií BV2 infikovaných toxoplazmou a bola potvrdená internalizácia gliómových buniek U87.Exozomálne profily expresie mikroRNA sa analyzovali pomocou polí mikroRNA a mikroRNA-21A-5p spojených s Toxoplasma gondii a triedením nádorov.Skúmali sme tiež hladiny mRNA génov spojených s nádorom v gliómových bunkách U87 zmenou hladín miR-21 v exozómoch a účinok exozómov na proliferáciu ľudských gliómových buniek U87.V exozómoch gliómových buniek U87 infikovaných Toxoplasma gondii je zvýšená expresia mikroRNA-21 a znížená aktivita protinádorových génov (FoxO1, PTEN a PDCD4).Exozómy odvodené od BV2 infikované toxoplazmou indukujú proliferáciu gliómových buniek U87.Exozómy indukujú rast buniek U87 v modeli myšacieho nádoru.Navrhujeme, že zvýšený exozomálny miR-21 v mikrogliách BV2 infikovaných toxoplazmou môže hrať dôležitú úlohu ako promótor bunkového rastu v bunkách gliómu U87 znížením regulácie protinádorových génov.
Odhaduje sa, že v roku 2018 bolo na celom svete diagnostikovaných viac ako 18,1 milióna prípadov pokročilej rakoviny, pričom každý rok sa diagnostikuje približne 297 000 nádorov centrálneho nervového systému (1,6 % všetkých nádorov)1.Predchádzajúci výskum ukázal, že rizikové faktory pre rozvoj ľudských mozgových nádorov zahŕňajú rôzne chemické produkty, rodinnú anamnézu a ionizujúce žiarenie z terapeutických a diagnostických zariadení hlavy.Presná príčina týchto malignít však nie je známa.Približne 20 % všetkých druhov rakoviny na celom svete je spôsobených infekčnými agens vrátane vírusov, baktérií a parazitov3,4.Infekčné patogény narúšajú genetické mechanizmy hostiteľskej bunky, ako je oprava DNA a bunkový cyklus, a môžu viesť k chronickému zápalu a poškodeniu imunitného systému5.
Infekčné agens spojené s ľudskou rakovinou sú najbežnejšími vírusovými patogénmi, vrátane ľudských papilomavírusov a vírusov hepatitídy B a C.Parazity môžu tiež zohrávať potenciálnu úlohu pri rozvoji rakoviny u ľudí.Niekoľko druhov parazitov, menovite Schistosoma, Opishorchis viverrini, O. felineus, Clonorchis sinensis a Hymenolepis nana, sa podieľajú na rôznych typoch rakoviny u ľudí 6,7,8.
Toxoplasma gondii je intracelulárny prvok, ktorý reguluje mikroprostredie infikovaných hostiteľských buniek.Odhaduje sa, že tento parazit infikuje približne 30 % svetovej populácie, čím ohrozuje celú populáciu9,10.Toxoplasma gondii môže infikovať životne dôležité orgány vrátane centrálneho nervového systému (CNS) a spôsobiť vážne ochorenia, ako je fatálna meningitída a encefalitída, najmä u pacientov s oslabenou imunitou9.Toxoplasma gondii však môže tiež zmeniť prostredie infikovaného hostiteľa moduláciou bunkového rastu a imunitných reakcií u imunokompetentných jedincov, čo vedie k udržaniu asymptomatickej chronickej infekcie9,11.Je zaujímavé, že vzhľadom na koreláciu medzi prevalenciou T. gondii a incidenciou mozgového nádoru niektoré správy naznačujú, že zmeny prostredia hostiteľa in vivo v dôsledku chronickej infekcie T. gondii pripomínajú mikroprostredie nádoru.
Exozómy sú známe ako medzibunkové komunikátory, ktoré dodávajú biologický obsah, vrátane proteínov a nukleových kyselín, zo susedných buniek16,17.Exozómy môžu ovplyvňovať biologické procesy súvisiace s nádorom, ako je antiapoptóza, angiogenéza a metastázy v mikroprostredí nádoru.Najmä miRNA (miRNA), malé nekódujúce RNA s dĺžkou približne 22 nukleotidov, sú dôležitými post-transkripčnými génovými regulátormi, ktoré kontrolujú viac ako 30 % ľudskej mRNA prostredníctvom miRNA-indukovaného umlčacieho komplexu (miRISC).Toxoplasma gondii môže narušiť biologické procesy riadením expresie miRNA v infikovaných hostiteľoch.Hostiteľské miRNA obsahujú dôležité signály na reguláciu biologických procesov hostiteľa na dosiahnutie stratégie prežitia parazita.Štúdium zmien v profile miRNA hostiteľa po infekcii T. gondii nám teda môže pomôcť jasnejšie pochopiť interakciu medzi hostiteľom a T. gondii.Vskutku, Thirugnanam a kol.15 naznačil, že T. gondii podporuje karcinogenézu mozgu zmenou svojej expresie na špecifických hostiteľských miRNA spojených s rastom nádoru a zistil, že T. gondii môže spôsobiť gliómy u experimentálnych zvierat.
Táto štúdia sa zameriava na zmenu exozomálneho miR-21 v hostiteľskej mikroglii infikovanej Toxoplasma BV2.Pozorovali sme možnú úlohu zmeneného exozomálneho miR-21 v raste gliómových buniek U87 v dôsledku retencie v jadre FoxO1 / p27, ktoré je cieľom nadmerne exprimovaného miR-21.
Exozómy odvodené z BV2 sa získali pomocou diferenciálnej centrifugácie a validovali sa rôznymi metódami, aby sa zabránilo kontaminácii bunkovými zložkami alebo inými vezikulami.Elektroforéza na SDS-polyakrylamidovom géli (SDS-PAGE) ukázala odlišné vzory medzi proteínmi extrahovanými z buniek BV2 a exozómami (obrázok 1A) a vzorky sa hodnotili na prítomnosť Alix, ktorá sa analyzovala Western blottingom exozomálnych proteínových markerov v .Značenie Alix sa zistilo v exozómových proteínoch, ale nie v proteínoch bunkového lyzátu BV2 (obr. 1B).Okrem toho sa purifikovaná RNA z exozómov odvodených z BV2 analyzovala pomocou bioanalyzátora.Ribozomálne podjednotky 18S a 28S boli zriedkavo pozorované v migračnom vzore exozomálnej RNA, čo naznačuje spoľahlivú čistotu (obrázok 1C).Nakoniec, transmisná elektrónová mikroskopia ukázala, že pozorované exozómy boli veľké asi 60–150 nm a mali pohárovitú štruktúru typickú pre morfológiu exozómov (obr. 1D).
Charakterizácia exozómov odvodených z buniek BV2.(A) Strana karty bezpečnostných údajov.Proteíny boli izolované z buniek BV2 alebo exozómov odvodených z BV2.Proteínové vzory sa medzi bunkami a exozómami líšia.(B) Western blot analýza exozomálneho markera (Alix).(C) Hodnotenie purifikovanej RNA z buniek BV2 a exozómov odvodených od BV2 pomocou bioanalyzátora.Ribozomálne podjednotky 18S a 28S v bunkách BV2 sa teda zriedkavo našli v exozomálnej RNA.(D) Transmisná elektrónová mikroskopia ukázala, že exozómy izolované z buniek BV2 boli negatívne zafarbené 2% uranylacetátom.Exozómy majú veľkosť približne 60-150 nm a majú tvar pohára (Song a Jung, nepublikované údaje).
Bunková internalizácia exozómov odvodených od BV2 do ľudských gliómových buniek U87 sa pozorovala pomocou konfokálnej mikroskopie.Exozómy označené PKH26 sú lokalizované v cytoplazme buniek U87.Jadrá boli zafarbené pomocou DAPI (obr. 2A), čo naznačuje, že exozómy odvodené od BV2 môžu byť internalizované hostiteľskými bunkami a ovplyvňovať prostredie recipientných buniek.
Internalizácia exozómov odvodených od BV2 do gliómových buniek U87 a exozómov odvodených od BV2 infikovaných Toxoplasma RH indukovala proliferáciu gliómových buniek U87.(A) Exozómy pohltené bunkami U87 merané konfokálnou mikroskopiou.Gliómové bunky U87 sa inkubovali s exozómami označenými PKH26 (červená) alebo bez kontroly počas 24 hodín.Jadrá sa zafarbili DAPI (modrá) a potom sa pozorovali pod konfokálnym mikroskopom (stupnica: 10 μm, x 3000).(B) Proliferácia gliómových buniek U87 bola stanovená testom bunkovej proliferácie.Gliómové bunky U87 boli ošetrené exozómami počas uvedeného času. *P < 0,05 sa získalo Studentovým t testom. *P < 0,05 sa získalo Studentovým t testom. *P < 0,05 получено по t-критерию Стьюдента. *P < 0,05 podľa Studentovho t-testu. *P < 0,05 通过学生t 检验获得。 *P < 0,05 * P < 0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 získané pomocou Studentovho t-testu.
Po potvrdení internalizácie exozómov odvodených od BV2 do gliómových buniek U87 sme vykonali testy bunkovej proliferácie, aby sme preskúmali úlohu exozómov odvodených od BV2 odvodených od toxoplazmy pri vývoji ľudských gliómových buniek.Ošetrenie buniek U87 exozómami z buniek BV2 infikovaných T. gondii ukázalo, že exozómy odvodené od BV2 infikované T. gondii spôsobili významne vyššiu proliferáciu buniek U87 v porovnaní s kontrolou (obr. 2B).
Okrem toho mal rast buniek U118 rovnaké výsledky ako U87, pretože exozómy stimulované toxoplazmou spôsobili najvyššie úrovne proliferácie (údaje nie sú uvedené).Na základe týchto údajov môžeme naznačiť, že exozómy infikované toxoplazmou odvodené od BV2 hrajú dôležitú úlohu pri proliferácii gliómových buniek.
Aby sme preskúmali účinok exozómov odvodených od BV2 infikovaných toxoplazmou na vývoj nádoru, vstrekli sme gliómové bunky U87 do nahých myší pre model xenoštepu a injikovali sme exozómy odvodené od BV2 alebo exozómy odvodené od BV2 infikované RH.Po tom, čo sa nádory objavili po 1 týždni, bola každá experimentálna skupina 5 myší rozdelená podľa veľkosti nádoru, aby sa určil rovnaký počiatočný bod, a veľkosť nádoru sa merala počas 22 dní.
U myší s modelom xenoštepu U87 sa pozorovala významne väčšia veľkosť a hmotnosť nádoru v skupine exozómov infikovaných RH odvodenými od BV2 v deň 22 (obr. 3A, B).Na druhej strane nebol medzi exozómovou skupinou odvodenou od BV2 a kontrolnou skupinou po liečbe exozómom žiadny významný rozdiel vo veľkosti nádoru.Okrem toho myši s injekciou gliómových buniek a exozómov vizuálne vykazovali najväčší objem nádoru v skupine exozómov odvodených od BV2 infikovaných RH (obr. 3C).Tieto výsledky ukazujú, že exozómy infikované toxoplazmou odvodené od BV2 indukujú rast gliómu v modeli myšacieho nádoru.
Onkogenéza (AC) exozómov odvodených od BV2 v myšom modeli s xenoštepom U87.Veľkosť nádoru (A) a hmotnosť (B) sa významne zvýšili u nahých myší BALB/c liečených exozómami infikovanými RH odvodenými z BV2.Nahým myšiam BALB/c (C) sa subkutánne podalo 1 x 107 buniek U87 suspendovaných v zmesi Matrigel.Šesť dní po injekcii sa myšiam ošetrilo 100 μg exozómov odvodených od BV2.Veľkosť a hmotnosť nádoru sa merali v uvedených dňoch a po usmrtení. *P < 0,05. *P < 0,05. *Р < 0,05. *P < 0,05. *P < 0,05. *P < 0,05. *Р < 0,05. *P < 0,05.
Dáta ukázali, že 37 miRNA (16 nadmerne exprimovaných a 21 downexprimovaných) spojených s imunitou alebo vývojom nádoru bolo významne zmenených v mikrogliách po infekcii kmeňom Toxoplasma RH (obr. 4A).Relatívne hladiny expresie miR-21 medzi zmenenými miRNA boli potvrdené RT-PCR v reálnom čase v exozómoch odvodených od BV2, exozómoch ošetrených bunkami BV2 a U87.Expresia miR-21 ukázala významný nárast exozómov z buniek BV2 infikovaných Toxoplasma gondii (kmeň RH) (obr. 4B).Relatívne hladiny expresie miR-21 v bunkách BV2 a U87 sa zvýšili po absorpcii zmenených exozómov (obr. 4B).Relatívne hladiny expresie miR-21 v mozgových tkanivách pacientov s nádorom a myší infikovaných Toxoplasma gondii (kmeň ME49) boli vyššie ako u kontrol (obr. 4C).Tieto výsledky korelujú s rozdielmi medzi hladinami expresie predpovedaných a potvrdených mikroRNA in vitro a in vivo.
Zmeny v expresii exozomálneho miP-21a-5p v mikrogliách infikovaných Toxoplasma gondii (RH).(A) Ukazuje významné zmeny v siRNA spojené s imunitou alebo vývojom nádoru po infekcii T. gondii RH.(B) Relatívne hladiny expresie miR-21 boli detegované pomocou RT-PCR v reálnom čase v exozómoch odvodených od BV2, exozómoch ošetrených BV2 a bunkách U87.(C) Relatívne hladiny expresie miR-21 sa našli v mozgových tkanivách pacientov s nádorom (N=3) a myší infikovaných Toxoplasma gondii (kmeň ME49) (N=3). *P < 0,05 sa získalo Studentovým t testom. *P < 0,05 sa získalo Studentovým t testom. *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *P < 0,05 sa získalo pomocou Studentovho t-testu. *P < 0,05 通过学生t 检验获得。 *P < 0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 získané pomocou Studentovho t-testu.
Exozómy z buniek BV2 infikovaných RH viedli k rastu gliómov in vivo a in vitro (obr. 2, 3).Na detekciu relevantných mRNA sme skúmali hladiny mRNA protinádorových cieľových génov, forkhead box O1 (FoxO1), PTEN a programovanú bunkovú smrť 4 (PDCD4) v bunkách U87 infikovaných exozómami odvodenými z BV2 alebo RH BV2.Bioinformatická analýza ukázala, že niekoľko génov spojených s nádorom, vrátane génov FoxO1, PTEN a PDCD4, má väzbové miesta miR-2121,22.Hladiny mRNA protinádorových cieľových génov boli znížené v exozómoch odvodených od BV2 infikovaných RH v porovnaní s exozómami odvodenými od BV2 (obr. 5A).FoxO1 vykazoval znížené hladiny proteínov v exozómoch odvodených od BV2 infikovaných RH v porovnaní s exozómami odvodenými od BV2 (obrázok 5B).Na základe týchto výsledkov by sme mohli potvrdiť, že exozómy odvodené z RH-infikovaného BV2 downregulujú anti-onkogénne gény, pričom si zachovávajú svoju úlohu pri raste nádoru.
Exozómy BV2 infikované toxoplazmou RH indukujú supresiu protinádorových génov v gliómových bunkách U87 exozómami odvodenými od BV2 infikovaných toxoplazmou RH.(A) PCR v reálnom čase expresie FoxO1, PTEN a PDCD4 v exozómoch odvodených z BV2 infikovaného T. gondii RH v porovnaní s exozómami PBS.Ako kontrola sa použila p-aktínová mRNA.(B) Expresia FoxO1 bola stanovená Western blotovaním a údaje denzitometrie boli štatisticky vyhodnotené pomocou programu ImageJ. *P < 0,05 sa získalo Studentovým t testom. *P < 0,05 sa získalo Studentovým t testom. *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *P < 0,05 sa získalo pomocou Studentovho t-testu. *P < 0,05 通过学生t 检验获得。 *P < 0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 získané pomocou Studentovho t-testu.
Na pochopenie účinku miP-21 v exozómoch na génovú reguláciu spojenú s nádorom boli bunky U87 transfekované inhibítorom miP-21 pomocou Lipofectamine 2000 a bunky boli zozbierané 24 hodín po transfekcii.Hladiny expresie Fox01 a p27 v bunkách transfekovaných inhibítormi miR-21 sa porovnávali s bunkami ošetrenými exozómami odvodenými od BV2 pomocou qRT-PCR (obr. 6A, B).Transfekcia inhibítora miR-21 do buniek U87 významne znížila expresiu Fox01 a p27 (obr. 6).
RH-infikovaný exozomálny miP-21 odvodený od BV2 zmenil expresiu FoxO1/p27 v gliómových bunkách U87.Bunky U87 sa transfekovali inhibítorom miP-21 s použitím Lipofectamine 2000 a bunky sa zozbierali 24 hodín po transfekcii.Hladiny expresie FoxO1 a p27 v bunkách transfekovaných inhibítormi miR-21 sa porovnávali s hladinami v bunkách ošetrených exozómami odvodenými od BV2 pomocou qRT-PCR (A, B).
Aby unikol imunitnej odpovedi hostiteľa, parazit Toxoplasma sa premení na tkanivovú cystu.Parazitujú rôzne tkanivá vrátane mozgu, srdca a kostrového svalstva počas celého života hostiteľa a modulujú imunitnú odpoveď hostiteľa.Okrem toho môžu regulovať bunkový cyklus a apoptózu hostiteľských buniek, čím podporujú ich proliferáciu14,24.Toxoplasma gondii prevažne infikuje hostiteľské dendritické bunky, neutrofily a monocyty/makrofágy, vrátane mozgových mikroglií.Toxoplasma gondii indukuje diferenciáciu makrofágov fenotypu M2, ovplyvňuje hojenie rán po infekcii patogénom a je tiež spojená s hypervaskularizáciou a granulomatóznou fibrózou.Táto behaviorálna patogenéza infekcie toxoplazmou môže súvisieť s markermi spojenými s vývojom nádoru.Nepriateľské prostredie regulované toxoplazmou môže pripomínať zodpovedajúcu prekancerózu.Preto sa dá predpokladať, že infekcia toxoplazmou by mala prispieť k rozvoju mozgových nádorov.V skutočnosti bola vysoká miera infekcie toxoplazmou hlásená v sére pacientov s rôznymi nádormi mozgu.Okrem toho môže byť Toxoplasma gondii ďalším karcinogénnym efektorom a pôsobiť synergicky, aby pomohla iným infekčným karcinogénom vyvinúť mozgové nádory.V tejto súvislosti stojí za zmienku, že P. falciparum a vírus Epstein-Barrovej synergicky prispievajú k vzniku Burkittovho lymfómu.
Úloha exozómov ako regulátorov v oblasti výskumu rakoviny bola rozsiahlo skúmaná.Úloha exozómov medzi parazitmi a infikovanými hostiteľmi však zostáva nedostatočne pochopená.Doteraz rôzne regulátory, vrátane vylučovaných proteínov, vysvetlili biologické procesy, ktorými prvokové parazity odolávajú útoku hostiteľa a udržiavajú infekciu.V poslednej dobe rastie koncepcia, že mikrovezikuly spojené s prvokmi a ich mikroRNA interagujú s hostiteľskými bunkami, aby vytvorili priaznivé prostredie na ich prežitie.Preto sú potrebné ďalšie štúdie na objavenie vzťahu medzi zmenenými exozomálnymi miRNA a proliferáciou gliómových buniek.Zmena mikroRNA (klastrové gény miR-30c-1, miR-125b-2, miR-23b-27b-24-1 a miR-17-92) sa viaže na promótor STAT3 v ľudských makrofágoch infikovaných toxoplazmou, je regulovaná a indukuje anti -apoptóza ako odpoveď na infekciu Toxoplasma gondii29.Infekcia toxoplazmou zvyšuje expresiu miR-17-5p a miR-106b-5p, ktoré sú spojené s niekoľkými hyperproliferatívnymi ochoreniami30.Tieto údaje naznačujú, že hostiteľské miRNA regulované infekciou Toxoplasma sú dôležitými molekulami pre prežitie a patogenézu parazitov v biologickom správaní hostiteľa.
Zmenené miRNA môžu ovplyvniť rôzne typy správania počas iniciácie a progresie malígnych buniek vrátane gliómov: sebestačnosť rastových signálov, necitlivosť na signály inhibujúce rast, únik apoptózy, neobmedzený replikačný potenciál, angiogenéza, invázia a metastázy a zápal.V glióme boli zmenené miRNA identifikované v niekoľkých štúdiách profilovania expresie.
V tejto štúdii sme potvrdili vysoké hladiny expresie miRNA-21 v hostiteľských bunkách infikovaných toxoplazmou.miR-21 bola identifikovaná ako jedna z najčastejšie nadmerne exprimovaných mikroRNA v solídnych nádoroch vrátane gliómov 33 a jej expresia koreluje so stupňom gliómu.Hromadné dôkazy naznačujú, že miR-21 je nový onkogén, ktorý pôsobí ako antiapoptotický faktor pri raste gliómu a je vysoko nadmerne exprimovaný v tkanivách a plazme pri malignitách ľudského mozgu.Je zaujímavé, že inaktivácia miR-21 v gliómových bunkách a tkanivách spúšťa inhibíciu bunkovej proliferácie v dôsledku apoptózy závislej od kaspázy.Bioinformatická analýza miR-21 predpovedaných cieľov odhalila viaceré nádorové supresorové gény spojené s dráhami apoptózy, vrátane programovanej bunkovej smrti 4 (PDCD4), tropomyozínu (TPM1), PTEN a forkhead boxu O1 (FoxO1), s miR-2121 väzbovým miestom..22.38.
FoxO1, ako jeden z transkripčných faktorov (FoxO), sa podieľa na vývoji rôznych typov ľudskej rakoviny a môže regulovať expresiu nádorových supresorových génov, ako sú p21, p27, Bim a FasL40.FoxO1 môže viazať a aktivovať inhibítory bunkového cyklu, ako je p27, aby potlačil rast buniek.Okrem toho je FoxO1 kľúčovým efektorom signalizácie PI3K / Akt a reguluje mnohé biologické procesy, ako je progresia bunkového cyklu a diferenciácia buniek prostredníctvom aktivácie transkripcie p2742.
Na záver sa domnievame, že exozomálny miR-21 odvodený z mikroglií infikovaných toxoplazmou môže hrať dôležitú úlohu ako regulátor rastu gliómových buniek (obr. 7).Na nájdenie priameho spojenia medzi exozomálnym miR-21, zmenenou infekciou toxoplazmou a rastom gliómu sú však potrebné ďalšie štúdie.Očakáva sa, že tieto výsledky poskytnú východiskový bod pre štúdium vzťahu medzi infekciou toxoplazmou a výskytom gliómu.
V tejto štúdii je navrhnutý schematický diagram mechanizmu karcinogenézy gliómu (mozgu).Autor kreslí v PowerPointe 2019 (Microsoft, Redmond, WA).
Všetky experimentálne protokoly v tejto štúdii, vrátane použitia zvierat, boli v súlade so štandardnými etickými pokynmi Výboru pre starostlivosť o zvieratá a používateľov v Soule National University a boli schválené Inštitucionálnou revíznou radou Lekárskej fakulty Národnej univerzity v Soule (IRB číslo SNU- 150715).-2).Všetky experimentálne postupy sa uskutočnili v súlade s odporúčaniami ARRIVE.
BV2 myšie mikroglie a ľudské gliómové bunky U87 sa kultivovali v Dulbeccovom modifikovanom Eagleovom médiu (DMEM; Welgene, Soul, Kórea) a v médiu Roswell Park Memorial Institute (RPMI; Welgene), z ktorých každá obsahuje 10 % fetálneho hovädzieho séra, 4 mM l- glutamín, 0,2 mM penicilín a 0,05 mM streptomycín.Bunky sa kultivovali v inkubátore s 5 % C02 pri 37 °C.Ďalšia gliómová bunková línia, U118, sa použila na porovnanie s bunkami U87.
Na izoláciu exozómov z kmeňov RH a ME49 infikovaných T. gondii sa tachyzoity T. gondii (kmeň RH) odobrali z brušnej dutiny 6-týždňových myší BALB/c, ktorým sa injekcia podala 3 až 4 dni predtým.Tachyzoity boli trikrát premyté PBS a purifikované centrifugáciou v 40 % Percoll (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)43.Na získanie tachyzoitov kmeňa ME49 sa myšiam BALB/c intraperitoneálne injikovalo 20 tkanivových cýst a transformácia tachyzoitov v cystách sa zhromaždila premytím brušnej dutiny 6. až 8. deň po infekcii (PI).Myši infikované PBS.Tachyzoity ME49 sa pestovali v bunkách doplnených 100 μg/ml penicilínu (Gibco/BRL, Grand Island, NY, USA), 100 μg/ml streptomycínu (Gibco/BRL) a 5 % fetálneho hovädzieho séra (Lonza, Walkersville, MD) .., USA) pri 37 °C a 5 % oxidu uhličitého.Po kultivácii vo Vero bunkách prešli ME49 tachyzoity dvakrát cez ihlu 25 gauge a potom cez 5 um filter, aby sa odstránili zvyšky a bunky.Po premytí boli tachyzoity resuspendované v PBS44.Tkanivové cysty Toxoplasma gondii kmeň ME49 sa udržiavali intraperitoneálnou injekciou cýst izolovaných z mozgu infikovaných myší C57BL/6 (Orient Bio Animal Center, Seongnam, Kórea).Mozgy myší infikovaných ME49 sa odobrali po 3 mesiacoch PI a rozomleli sa pod mikroskopom, aby sa izolovali cysty.Infikované myši boli držané v špeciálnych podmienkach bez patogénov (SPF) na lekárskej fakulte Národnej univerzity v Soule.
Celková RNA bola extrahovaná z BV2-odvodených exozómov, BV2 buniek a tkanív pomocou miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Nemecko) podľa pokynov výrobcu, vrátane inkubačného času pre elučný krok.Koncentrácia RNA bola stanovená na spektrofotometri NanoDrop 2000.Kvalita RNA mikročipov bola hodnotená pomocou bioanalyzátora Agilent 2100 (Agilent Technologies, Amstelveen, Holandsko).
DMEM s 10 % FBS chudobným na exozómy sa pripravil ultracentrifugáciou pri 100 000 g počas 16 hodín pri 4 °C a prefiltroval sa cez 0,22 um filter (Nalgene, Rochester, NY, USA).Bunky BV2, 5 x 105, sa kultivovali v DMEM obsahujúcom 10 % FBS zbaveného exozómov a 1 % antibiotík pri 37 °C a 5 % C02.Po 24 hodinách inkubácie boli k bunkám pridané tachyzoity kmeňa RH alebo ME49 (MOI = 10) a neinvazívne parazity boli odstránené do hodiny a znovu naplnené DMEM.Exozómy z buniek BV2 boli izolované modifikovanou diferenciálnou centrifugáciou, čo je najpoužívanejšia metóda.Resuspendujte pelet exozómu v 300 µl PBS na analýzu RNA alebo proteínu.Koncentrácia izolovaných exozómov sa stanovila pomocou súpravy na testovanie proteínov BCA (Pierce, Rockford, IL, USA) a spektrofotometra NanoDrop 2000.
Precipitáty z buniek BV2 alebo exozómy odvodené od BV2 sa lyzovali v proteínovom extrakčnom roztoku PRO-PREP™ (iNtRon Biotechnology, Seongnam, Kórea) a proteíny sa naniesli na 10% SDS polyakrylamidové gély zafarbené Coomassie brilantnou modrou.Okrem toho sa proteíny preniesli na PVDF membrány na 2 hodiny.Western bloty boli validované s použitím protilátky Alix (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) ako exozomálneho markera.HRP-konjugovaný kozí anti-myší IgG (H+L) (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, USA) a analyzátor luminiscenčného obrazu LAS-1000 plus (Fuji Photographic Film, Tokyo, Japonsko) sa použili ako sekundárna protilátka..Na štúdium veľkosti a morfológie exozómov sa uskutočnila transmisná elektrónová mikroskopia.Exozómy izolované z buniek BV2 (6,40 ug/ul) sa pripravili na uhlíkom potiahnutých sieťkach a negatívne sa farbili s 2% uranylacetátom počas 1 minúty.Pripravené vzorky boli pozorované pri urýchľovacom napätí 80 kV pomocou JEOL 1200-EX II (Tokio, Japonsko) vybaveného ES1000W Erlangshen CCD kamerou (Gatan, Pleasanton, CA, USA).
Exozómy odvodené od BV2 sa farbili pomocou súpravy PKH26 Red Fluorescent Linker Kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) počas 15 minút pri teplote miestnosti.Bunky U87, 2 x 105, s PKH26-značenými exozómami (červené) alebo bez exozómov ako negatívnou kontrolou, boli inkubované pri 37 °C počas 24 hodín v 5% CO2 inkubátore.Bunkové jadrá U87 boli zafarbené DAPI (modrá), bunky U87 boli fixované v 4% paraformaldehyde počas 15 minút pri 4 °C a potom analyzované v systéme konfokálneho mikroskopu Leica TCS SP8 STED CW (Leica Microsystems, Mannheim, Nemecko).pozorovateľné.
cDNA bola syntetizovaná zo siRNA pomocou syntézy prvého vlákna Mir-X siRNA a súpravy SYBR qRT-PCR (Takara Bio Inc., Shiga, Japonsko).Kvantitatívna PCR v reálnom čase sa uskutočnila pomocou detekčného systému PCR v reálnom čase iQ5 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) s použitím primérov a templátov zmiešaných s SYBR Premix.DNA sa amplifikovala počas 40 cyklov denaturácie pri 95 °C počas 15 s a anelácie pri 60 °C počas 60 s.Údaje z každej reakcie PCR sa analyzovali pomocou modulu analýzy údajov softvéru optického systému iQ™5 (Bio-Rad).Relatívne zmeny v génovej expresii medzi vybranými cieľovými génmi a β-aktín/siRNA (a U6) sa vypočítali pomocou metódy štandardnej krivky.Použité sekvencie primérov sú uvedené v tabuľke 1.
3 x 104 gliómových buniek U87 sa naočkovalo na 96-jamkové doštičky a zmiešalo sa s exozómami infikovanými toxoplazmou odvodenými z BV2 (50 μg/ml) alebo nepulznými exozómami odvodenými z BV2 (50 μg/ml) ako kontroly po 12, 18 a 36 hodinách .Rýchlosť bunkovej proliferácie sa určila pomocou súpravy Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japonsko) (doplnkové obrázky S1-S3)46.
5-týždňové samice nahých myší BALB/c boli zakúpené od Orient Bio (Seongnam-si, Južná Kórea) a držané jednotlivo v sterilných klietkach pri teplote miestnosti (22 ± 2 ° C) a vlhkosti (45 ± 15 ° C).%) pri izbovej teplote (22 ± 2 °C) a vlhkosti (45 ± 15 %).12-hodinový svetelný cyklus a 12-hodinový cyklus tmy sa uskutočňoval pod SPF (Soul National University School of Medicine Animal Center).Myši boli náhodne rozdelené do troch skupín po 5 myšiach a všetkým skupinám sa subkutánne injikovalo 400 ml PBS obsahujúceho 1 x 107 gliómových buniek U87 a BD Matrigel™ so zníženým rastovým faktorom (BD Science, Miami, FL, USA).Šesť dní po injekcii nádoru sa do miesta nádoru vstreklo 200 mg exozómov odvodených z buniek BV2 (s/bez infekcie toxoplazmou).Dvadsaťdva dní po infekcii nádoru sa veľkosť nádoru u myší v každej skupine merala posuvným meradlom trikrát týždenne a objem nádoru sa vypočítal podľa vzorca: 0,5 x (šírka) x 2 x dĺžka.
Analýza expresie mikroRNA pomocou miRCURYTM LNA miRNA poľa, 7. generácia has, mmu a rno poľa (EXIQON, Vedbaek, Dánsko) pokrývajúca 1119 dobre charakterizovaných myší spomedzi 3100 ľudských, myších a potkaních miRNA zachytávacích sond.Počas tohto postupu sa z 5'-fosfátu odstránilo 250 až 1000 ng celkovej RNA pôsobením alkalickej fosfatázy z teľacích čriev, po čom nasledovalo značenie zeleným fluorescenčným farbivom Hy3.Označené vzorky sa potom hybridizovali vložením mikročipových sklíčok s použitím súpravy hybridizačnej komory (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) a súpravy hybridizačných sklíčok (Agilent Technologies).Hybridizácia sa uskutočňovala 16 hodín pri 56 °C, potom sa mikročipy premyli v súlade s odporúčaniami výrobcu.Spracované mikročipové sklíčka sa potom skenovali pomocou mikročipového skenerového systému Agilent G2565CA (Agilent Technologies).Naskenované obrázky sa importovali pomocou softvéru Agilent Feature Extraction verzie 10.7.3.1 (Agilent Technologies) a intenzita fluorescencie každého obrázku sa kvantifikovala pomocou zodpovedajúceho súboru GAL upraveného protokolu Exiqon.Údaje z mikročipov pre aktuálnu štúdiu sú uložené v databáze GEO pod prístupovým číslom GPL32397.
Profily expresie zrelých exozomálnych miRNA v mikrogliách kmeňov RH alebo ME49 infikovaných toxoplazmou sa analyzovali pomocou rôznych sieťových nástrojov.miRNA spojené s vývojom nádoru boli identifikované pomocou miRWalk2.0 (http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de) a odfiltrované s normalizovanou intenzitou signálu (log2) vyššou ako 8,0.Medzi miRNA sa zistilo, že rozdielne exprimované miRNA sú viac ako 1,5-krát zmenené filtračnou analýzou miRNA zmenených kmeňmi RH alebo ME49 infikovanými T. gondii.
Bunky sa naočkovali na šesťjamkové platne (3 x 105 buniek/jamku) v opti-MEM (Gibco, Carlsbad, CA, USA) s použitím Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).Transfekované bunky sa kultivovali 6 hodín a potom sa médium vymenilo za čerstvé kompletné médium.Bunky sa zozbierali 24 hodín po transfekcii.
Štatistická analýza sa uskutočňovala hlavne pomocou Studentovho t-testu so softvérom Excel (Microsoft, Washington, DC, USA).Na experimentálnu analýzu zvierat sa uskutočnila dvojcestná ANOVA s použitím softvéru Prism 3.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). P-hodnoty < 0,05 sa považovali za štatisticky významné. P-hodnoty < 0,05 boli považované za štatisticky významné. Значения P <0,05 считались статистически значимыми. Hodnoty P < 0,05 sa považovali za štatisticky významné. P 值 < 0,05 被认为具有统计学意义。 P 值 < 0,05 Значения P <0,05 считались статистически значимыми. Hodnoty P < 0,05 sa považovali za štatisticky významné.
Všetky experimentálne protokoly použité v tejto štúdii boli schválené Inštitucionálnou revíznou radou Lekárskej fakulty Národnej univerzity v Soule (IRB číslo SNU-150715-2).
The data used in this study are available upon reasonable request from the first author (BK Jung; mulddang@snu.ac.kr). And the microarray data for the current study is deposited in the GEO database under registration number GPL32397.
Furley, J. a kol.Odhadovaná celosvetová incidencia a úmrtnosť na rakovinu v roku 2018: zdroje a metódy GLOBOCAN.Výklad.J. Ruck 144, 1941–1953 (2019).
Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Pohľad na rizikové faktory mozgových nádorov a ich terapeutické intervencie. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Pohľad na rizikové faktory mozgových nádorov a ich terapeutické intervencie.Rashid, S., Rehman, K. a Akash, MS Prehľad rizikových faktorov mozgových nádorov a hlavných terapeutických zásahov. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS 深入了解脑肿瘤的危险因素及其治疗干预措施。 Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Hlboké pochopenie rizikových faktorov mozgového nádoru a terapeutických zásahov.Rashid, S., Rehman, K. a Akash, MS Prehľad rizikových faktorov mozgových nádorov a hlavných terapeutických zásahov.Biomedicínska veda.Lekárnik.143, 112119 (2021).
Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Bakteriálne-vírusové interakcie pri rakovine ľudského orodigestívneho a ženského genitálneho traktu: Súhrn epidemiologických a laboratórnych dôkazov. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Bakteriálne-vírusové interakcie pri rakovine ľudského orodigestívneho a ženského genitálneho traktu: Súhrn epidemiologických a laboratórnych dôkazov.Kato I., Zhang J. a Sun J. Bakteriálne-vírusové interakcie pri rakovine ľudského gastrointestinálneho traktu a ženského genitálneho traktu: súhrn epidemiologických a laboratórnych údajov. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J.据总结. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Bakterio-vírusová interakcia v trávení ľudskej ústnej dutiny a ženskom reprodukčnom trakte: súhrn populárnych vedeckých poznatkov o chorobách a laboratórnych dôkazov.Kato I., Zhang J. a Sun J. Bakteriálne-vírusové interakcie pri rakovine ľudského gastrointestinálneho traktu a rakovine ženských pohlavných orgánov: súhrn epidemiologických a laboratórnych údajov.Rak 14, 425 (2022).
Magon, KL & Parish, JL Od infekcie k rakovine: Ako DNA nádorové vírusy menia centrálny metabolizmus uhlíka a lipidov hostiteľskej bunky. Magon, KL & Parish, JL Od infekcie k rakovine: Ako DNA nádorové vírusy menia centrálny metabolizmus uhlíka a lipidov hostiteľskej bunky.Mahon, KL a Parish, JL Fire infekcia na rakovinu: ako nádorové vírusy založené na DNA menia centrálny metabolizmus uhlíka a lipidov hostiteľskej bunky. Magon, KL & Parish, JL 从感染到癌症：DNA 肿瘤病毒如何改变宿主细胞的中心碳和脂质代脂质代脂质代脂质代脂质代脂质代脂质代脂质代何毒如何改变宿 Magon, KL & Parish, JL Od infekcie k rakovine: ako DNA nádorové vírusy menia centrálny metabolizmus uhlíka a lipidov hostiteľskej bunky.Mahon, KL a Parish, JL Ohne infekciu na rakovinu: ako DNA nádorové vírusy menia centrálny metabolizmus uhlíka a lipidov v hostiteľských bunkách.Otvorená biológia.11, 210 004 (2021).
Correia da Costa, JM a kol.Katecholové estrogény schistozómov a pečeňových motolíc a rakovina spojená s helmintom.vpredu.vnútri horúce.5, 444 (2014).