Giardia duodenum je parazitický organizmus, ktorý spôsobuje giardiázu, črevnú infekciu, ktorá je obzvlášť častá u malých detí s klinickými príznakmi hnačky.Už sme predtým uviedli, že extracelulárny G. duodenalis spúšťa aktiváciu nukleotidov viažucich intracelulárny receptor 3 podobný oligomerizácii (NLRP3) a reguluje zápalové reakcie hostiteľa prostredníctvom sekrécie extracelulárnych vezikúl (EV).Presné molekulárne vzorce duodenokokového EV (GEV) spojeného s patogénom, ktorý sa podieľa na tomto procese, a úloha zápalu NLRP3 pri giardiáze však zostáva ešte objasniť.
Rekombinantné eukaryotické expresné plazmidy pcDNA3.1(+)-alfa-2 a alfa-7.3 giardins v GEV boli skonštruované, transfekované do myších primárnych peritoneálnych makrofágov a detegované meraním zápalovej cieľovej molekuly kaspázy-1.Hladina expresie p20 sa testovala..G. duodenalis alfa-2 a alfa-7,3 giardines boli pôvodne identifikované meraním zápalu NLRP3 (NLRP3, pro-interleukín-1 beta [IL-1p], pro-kaspázy-1 a kaspázy-1 p20), sekrécie IL.Hladiny 1p, hladiny oligomerizácie apoptotického bodkovaného proteínu (ASC) a imunofluorescenčná lokalizácia NLRP3 a ASC.Úloha zápalu NLRP3 v patogenite G. duodenalis sa potom hodnotila pomocou myší, u ktorých bola blokovaná aktivácia NLRP3 (myši blokované NLRP3) a monitorovali sa patologické zmeny telesnej hmotnosti, duodenálna parazitická záťaž a duodenálne tkanivo.Okrem toho sme skúmali, či hiardíny alfa-2 a alfa-7,3 indukujú sekréciu IL-1p in vivo prostredníctvom zápalu NLRP3 a určili sme úlohu týchto molekúl v patogenite G. duodenalis u myší.
Alfa-2 a alfa-7,3 giardiny indukujú aktiváciu zápalu NLRP3 in vitro.To viedlo k aktivácii p20 kaspázy-1, zvýšeniu hladín expresie proteínov NLRP3, pro-IL-1p a pro-kaspázy-1, významnému zvýšeniu sekrécie IL-1p, tvorbe škvŕn ASA v cytoplazme a indukcii oligomerizácie ASA.Zápal NLRP3 Strata penisu zhoršuje patogenitu G. duodenalis u myší.Myši liečené cystami žalúdočnou sondou od myší blokovaných NLRP3 vykazovali zvýšený počet trofozoitov a vážne poškodenie duodenálnych klkov, ktoré sa vyznačujú nekrotickými kryptami so zmenšenými a rozvetvenými.Experimenty in vivo ukázali, že giardiny alfa-2 a alfa-7.3 môžu indukovať sekréciu IL-1 p prostredníctvom zápalu NLRP3 a imunizácia giardinami alfa-2 a alfa-7.3 znížila patogenitu G. duodenalis u myší.
Celkovo vzaté, výsledky tejto štúdie naznačujú, že Giardia alfa-2 a alfa-7.3 spôsobujú upreguláciu hostiteľského zápalu NLRP3 a znižujú infekčnosť G. duodenalis u myší, čo sú sľubné ciele na prevenciu giardiázy.
Giardia duodenum je extracelulárny protozoálny parazit, ktorý žije v tenkom čreve a spôsobuje ročne 280 miliónov prípadov giardiázy s hnačkou, najmä u malých detí v rozvojových krajinách [1].Ľudia sa nakazia pitím vody alebo potravín kontaminovaných cystami M. duodenum, ktoré sa potom dostávajú do žalúdka a vylučujú sa žalúdočnými šťavami.Trofozoity Giardia duodenum sa prichytávajú na duodenálny epitel, čo spôsobuje nevoľnosť, vracanie, hnačku, bolesti brucha a chudnutie.Jedinci s imunodeficienciou a cystickou fibrózou sú náchylní na infekciu.Infekcia sa môže vyskytnúť aj pri orálnom a análnom sexe [2].Lieky ako metronidazol, tinidazol a nitazoxanid sú preferovanými možnosťami liečby duodenálnych infekcií [3].Tieto chemoterapeutické lieky však spôsobujú nežiaduce vedľajšie účinky, ako je nevoľnosť, karcinogenéza a genotoxicita [4].Preto je potrebné vyvinúť účinnejšie stratégie na prevenciu infekcie G. duodenalis.
Inflammasómy sú triedou cytosolických proteínových komplexov, ktoré sú súčasťou vrodenej imunitnej odpovede, pomáhajú pri obrane proti invázii patogénov a sprostredkúvajú zápalové reakcie [5].Spomedzi týchto zápalov bol rozsiahlo študovaný zápal viazania nukleotidov (NOD) receptor 3 (NLRP3), oligomerizácia viazania nukleotidov (NLRP3) podobný zápalu nukleotidov, pretože ho možno detegovať rôznymi patogénmi/poškodením asociovanými molekulárnymi vzormi (PAMP/ DAMP), rozpoznáva, aktivuje vrodený imunitný systém.a reguluje črevnú homeostázu pri mnohých zápalových ochoreniach [6,7,8].Pozostáva z receptora rozpoznávania vzoru (PRR) NLRP3, adaptorového apoptotického bodkovaného proteínu (ASC) a efektorovej prokaspázy-1 alebo prokaspázy-11.Inflammasóm NLRP3 pôsobí ako hostiteľ proti invázii patogénov, ako sa pozorovalo v štúdiách Neospora caninum [9], Paracoccidioides brasiliensis [10] a Leishmania.[11], ale tiež sa uvádza, že aktivácia zápalu NLRP3 obmedzuje ochranné imunitné reakcie a zhoršuje progresiu ochorenia, napríklad u červov [12].Na základe našich predchádzajúcich zistení sme uviedli, že extracelulárny G. duodenalis spúšťa intracelulárnu aktiváciu zápalu NLRP3 a moduluje zápalové reakcie hostiteľa vylučovaním extracelulárnych vezikúl (EV) [13].Úlohu zápalu NLRP3 pri infekcii G. duodenalis in vivo však ešte treba určiť.
Giardiny boli pôvodne opísané ako štrukturálne zložky cytoskeletu G. duodenalis a hrajú dôležitú úlohu v pohyblivosti trofozoitov a prichytávaní epitelových buniek v tenkom čreve.Na lepšie prispôsobenie sa prostrediu a zvýšenie ich patogenity si G. duodenalis trophozoites vyvinuli unikátnu cytoskeletálnu štruktúru pozostávajúcu z 8 bičíkov, 1 stredného tela a 1 ventrálneho disku [14].Trofozoity Giardia duodenum využívajú svoj cytoskelet na prenikanie do horného tenkého čreva, najmä do dvanástnika, a prichytávajú sa k enterocytom.Neustále migrujú a pripájajú sa k epitelovým bunkám pomocou bunkového metabolizmu.Preto existuje úzky vzťah medzi ich cytoskeletom a virulenciou.Giardiny špecifické pre Giardia duodenum sú súčasťou štruktúry cytoskeletu [15] a delia sa do štyroch tried: α-, β-, γ- a δ-giardiny.Existuje 21 členov rodiny α-giardinov, z ktorých všetky majú schopnosť viazať fosfolipidy závislú od vápnika [16].Tiež spájajú cytoskelet s bunkovou membránou.U jedincov s hnačkou spôsobenou G. duodenalis sú α-giardiny počas infekcie vysoko exprimované a imunoreaktívne [17].Heterologické vakcíny na báze Giardia alfa-1 chránili u myší proti giardiáze a sú potenciálnymi kandidátskymi antigénmi pre vývoj vakcíny [18].Alfa-8 giardin, lokalizovaný v plazmatickej membráne a bičíkoch, ale nie vo ventrálnom disku, zvyšuje motilitu a rýchlosť rastu trofozoitov v G. duodenalis [19].Alfa-14 giardin sa pripája k mikrotubulovým štruktúram na bičíkoch a ovplyvňuje životaschopnosť G. duodenalis [20].Alfa-11 giardin je prítomný v hojnosti počas celého životného cyklu a nadmerná expresia alpha-11 giardinu poškodzuje samotný G. duodenalis [21].Nie je však jasné, či alfa-2 giardin a alfa-7,3 giardin sú ochranné proti infekcii G. duodenalis a ich základným mechanizmom.
V tejto štúdii boli rekombinantné eukaryotické expresné plazmidy pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardin a pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardine transfekované do myších primárnych peritoneálnych makrofágov na aktiváciu hostiteľského NLRP3.Potom sa skrínovali zápalové ciele.Hodnotili sme aj úlohu zápalu NLRP3 v patogenite G. duodenalis, skúmali sme, či alfa-2 a alfa-7,3 giardiny indukujú aktiváciu zápalu NLRP3 in vivo, a určili sme, že tieto dve úlohy giardinov v patogenite G. duodenalis.Naším spoločným cieľom bolo vyvinúť sľubné ciele na prevenciu infekcie G. duodenalis.
Samice myší divokého typu (WT) C57BL/6 vo veku 5 až 8 týždňov boli zakúpené od Liaoning Changsheng Experimental Animal Center (Liaoning, Čína).Myši mali voľný prístup k vode, dostávali sterilizovanú potravu a boli držané v 12/12 hodinovom cykle svetlo/tma.Pred infekciou myši dostávali antibiotiká ad libitum v pitnej vode doplnenej o ampicilín (1 mg/ml), vankomycín (1 mg/ml) a neomycín (1,4 mg/ml) (všetky zakúpené v Šanghaji, Čína, umelé organizmy) [22 ].].Myši, ktoré stratili schopnosť jesť a piť na > 24 hodín a stratili ≥ 20 % telesnej hmotnosti, boli humánne usmrtené cervikálnou dislokáciou.
Trofozoity WB G. duodenalis (American Type Culture Collection, Manassas, USA) boli doplnené 12,5 % fetálnym hovädzím sérom (FBS; Every Green, Zhejiang, Čína) a 0,1 % hovädzou žlčou (Sigma-Aldrich, St. Missouri, USA ).USA) za mikroaeróbnych podmienok.Konfluentné trofozoity boli zozbierané na ľade a pasážované v pomere 1:4 na ďalšiu reprodukciu.
Cysty Giardia duodenum boli indukované tak, ako je opísané vyššie [23], trofozoity boli zozbierané v logaritmickej fáze a potom zriedené médiom indukujúcim enkapsuláciu, pH 7,1 (modifikovaný TYI-S-33) na konečnú koncentráciu 1 × 106 trofozoitov/ml.koncentrácia žlče 0,05 % stredná).Trofozoity sa kultivovali v anaeróbnych podmienkach pri 37 °C až do logaritmickej rastovej fázy.Vymeňte médium za médium vyvolávajúce cysty (pH 7,8; ​​modifikované médium TYI-S-33 s 1 % koncentráciou žlče) a kultivujte G. duodenalis pri 37 °C počas 48 – 96 hodín, počas ktorých sa pod mikroskopom pozorovala tvorba cýst.Potom, čo väčšina trofozoitov indukovala tvorbu cýst, bola kultivačná zmes zozbieraná a resuspendovaná v sterilnej deionizovanej vode, aby sa lyzovali zostávajúce trofozoity.Cysty sa spočítali a skladovali pri 4 °C na následné analýzy cez žalúdočnú sondu u myší.
Extracelulárne vezikuly Giardia (GEV) boli obohatené, ako už bolo opísané [13].Trofozoity v logaritmickej rastovej fáze boli resuspendované v modifikovanom médiu TYI-S-33 pripravenom s FBS ochudobneným o exozómy (Biological Industries, Beit-Haemek, Izrael) na konečnú koncentráciu 1 x 106 parazitov/ml a inkubované počas 12 hodín.boli izolované zo supernatantu kultúry centrifugáciou pri 2000 g počas 10 minút, 10 000 g počas 45 minút a 100 000 g počas 60 minút.Precipitáty sa rozpustili vo fyziologickom roztoku pufrovanom fosfátom (PBS), kvantifikovali sa pomocou súpravy na stanovenie proteínov BCA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) a skladovali sa pri -80 °C alebo sa použili priamo na ďalšie analýzy.
Primárne myšie peritoneálne makrofágy boli pripravené tak, ako bolo opísané vyššie [24].V stručnosti, myšiam (vo veku 6-8 týždňov) sa injikovalo (intraperitoneálne [ip]) 2,5 ml 2,98% tekutého tioglykolového média Difco (BD, Franklin Lakes, NJ, USA) a kŕmili sa 3-4 podnebia.Suspenzia makrofágov sa odobrala z brušnej dutiny myší po eutanázii a centrifugovala sa 3-krát pri 1000 g počas 10 minút.Zozbierané bunky sa detegovali prietokovou cytometriou s použitím markera CD11b, kým čistota buniek nebola >98 %, potom sa pridali na 6-jamkové doštičky na kultiváciu buniek (4,5 x 106 buniek/jamku) a inkubovali sa s 10 % FBS (Bioindustry) pri 37 °C.a 5 % CO2.
RNA bola extrahovaná z 1 × 107 trofozoitov v 1 ml činidla TRIzol (Vazyme, Nanjing, Čína), genómová DNA bola extrahovaná z celkovej RNA G. duodenalis pomocou MonScript dsDNázy (Monad, Wuhan, Čína) a bola syntetizovaná komplementárna DNA (cDNA) použitím MonScript RTIIII Super Mix (Monad) podľa pokynov výrobcu.
Informácie o sekvencii CDS pre cieľový gén G. duodenalis sa získali z NCBI GenBank.Použite Primer 5.0 na navrhnutie špecifických bezproblémových klonovacích primerov pre každý cieľový gén.Dopredný primér (5'-3') pozostáva z troch častí: prekrývajúcej sa sekvencie s linearizovaným vektorom pcDNA3.1(+) EcoRV (TGGTGGAATTCTGCAGAT) a štartovacích kodónov ATG a GNN (ak prvá báza nie je G).Toto sa robí na zlepšenie účinnosti výrazu.Okrem toho najmenej 16 bp kombinované bázy (obsah GC 40–60 %/Tm približne 55 °C).Reverzný primér (5'-3') pozostáva z dvoch častí, prekrývajúcej sa sekvencie s EcoRV-linearizovaným vektorom pcDNA3.1(+) (GCCGCCACTGTGCTGGAT) a kombinovanej bázy s veľkosťou aspoň 16 bp.(okrem posledných dvoch zastávok).bázy) kodón, ako je AA alebo GA, ktorý umožňuje rekombinantným plazmidom exprimovať ich označené proteíny).Sekvencie primérov sú uvedené v tabuľke 1 a boli syntetizované spoločnosťou Kangmet Biotechnology Co., Ltd. (Changchun, Čína).
Ciele sa amplifikovali pomocou Pfu DNA polymerázy (Tiangen, Peking, Čína) alebo Ex-taq (Takara Biomedical Technology [Beijing] Co., Ltd., Peking, Čína) s použitím pripravenej cDNA G. duodenalis ako templátu.Plazmid eukaryotického expresného vektora pcDNA3.1(+) bol linearizovaný reštrikčným enzýmom EcoRV a defosforylovaný pomocou Fast AP (Thermo Fisher Scientific).Linearizované fragmenty pcDNA3.1(+) a amplifikované fragmenty cieľového génu sa purifikovali pomocou súpravy na čistenie DNA gélu (Tiangen) a kvantifikovali sa pomocou Nanodrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientific).Fragment pcDNA3.1(+) a každý fragment cieľového génu sa rekombinovali s použitím klonovacej zmesi s jednoduchým zostavením MonClone (Monad Biotech Co., Ltd., Suzhou, Čína) a potvrdili sa sekvenovaním DNA pomocou Comate Bioscience Company Limited (Changchun, Čína)..
Plazmidy pcDNA3.1(+)-alfa-2 a pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 bez endotoxínu boli vytvorené pomocou súpravy SanPrep Plasmid Mini Kit bez endotoxínu (Sangon Biotech).Koncentrácia sa udržiavala nad 500 ng/ul, aby sa zaistilo, že EDTA v elučnom pufri nebude interferovať s testom transfekcie.Primárne myšie peritoneálne makrofágy sa kultivovali v 6-jamkových doštičkách s kompletným médiom RPMI 1640 (Biological Industries) počas 12 hodín, potom sa bunky 3-krát premyli v teplom PBS, aby sa odstránil penicilín a streptomycín, a potom sa v médiu doplnenom kompletným médiom.Plazmidy pcDNA3.1(+)-alfa-2 a pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 (2,5 ug) bez endotoxínu sa zriedili v 125 ul média s redukovaným sérom Opti-MEM (Gibco, Thermo Fisher Scientific)..Potom sa 5 ul transfekčného činidla Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) zriedilo v 125 ul média Opti-MEM s nízkym obsahom séra.Pripravte komplexy lipozóm-DNA zmiešaním zriedeného plazmidu bez endotoxínu s Lipofectamine 2000 a ponechaním zmesi pri teplote miestnosti počas 5 minút.Preneste komplexy oddelene do buniek v každej jamke a pomaly premiešajte.Po 4 hodinách sa médium bunkovej kultúry nahradilo 2 ml kompletného média RPMI 1640 a kultivácia pokračovala 24 hodín.K bunkám sa pridalo čerstvé kultivačné médium pre bunky a inkubovali sa počas rôznych časových bodov v závislosti od dizajnu testu.
Vzorky proteínov zo supernatantov a bunkových lyzátov boli pripravené tak, ako bolo opísané vyššie [25].Parametre membránového prenosu pre pro-IL-1p, pro-kaspázu-1, kaspázu-1 p20, NLRP3, p-aktín a His-tag boli 200 mA/90 min.Pre interleukín 1p (IL-1p; R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, USA), kaspázu-1 (p20) (Adipogen, Švajčiarsko) a NLRP3 (Adipogen SA, Epalinges, Švajčiarsko) a 1:5000 zacielenie na His tag (Amylet Scientific, Wuhan, Čína) a β-aktín (Proteintech, Wuhan, Čína).
Zosieťovanie s disukcinimid suberátom (DSS) sa uskutočnilo tak, ako bolo opísané vyššie [26].Bunky boli 3-krát premyté studeným PBS a kompletne lyzované ihlou 27 gauge v 50 ul ASC reakčného pufra (pH 8,0) obsahujúcom 25 mM Na2P04, 187,5 mM NaCI, 25 mM HEPES a 125 mM NaHC03.Zmes sa centrifugovala pri 5000 g počas 3 minút a peleta sa zošila s 10 ul DSS (25 mM v DMSO) a 40 ul ASC reakčného pufra počas 30 minút pri 37 °C.Po centrifugácii pri 5000 g počas 10 minút sa peleta rozpustila v roztoku 40 ul reakčného pufra ASC a 10 ul 6x pufra na nanášanie proteínov (TransGen, Peking, Čína) a potom sa roztok zastavil pri teplote miestnosti počas 15 minút. min., Potom varte 10 minút.Vzorky proteínov sa potom podrobili Western blotovaniu s použitím primárnych anti-ASC protilátok (Wanleibio, Shenyang, Čína) v pomere riedenia 1:500.
Podľa predtým opísaného postupu [13] sa supernatanty bunkovej kultúry zozbierali a sekrécia prozápalového cytokínu IL-1β sa stanovila pomocou súpravy ELISA myšieho IL-1 Beta (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific).Preveďte hodnoty OD450nm na koncentrácie proteínov pomocou štandardnej krivky IL-1β.
Bunky potiahnuté na krycích sklíčkach sa jemne premyli 3-krát v teplom PBS, fixovali sa vo fixatíve tkanivových buniek (Biosharp, Peking, Čína) počas 10 minút pri teplote miestnosti (RT), v 0,1 % Triton X-Permeabilize pri 100 °C (riedené v PBS; Biosharp ) počas 20 minút pri teplote miestnosti a blokovať v 5% hovädzom sérovom albumíne (v PBS) počas 2 hodín pri teplote miestnosti.Bunky sa potom inkubovali cez noc pri 4 °C s primárnymi protilátkami proti ASC (riedenie 1:100) alebo NLRP3 (riedenie 1:100) a kozím anti-králičím IgG(H+L) značeným Cy3 (1:400; EarthOx). , San Francisco, CA, USA) alebo FITC-konjugovaný kozí anti-myší IgG (1:400; Earthox) cez noc pri 37 °C v tme počas 1 hodiny.Jadrá sa farbili s Hoechst 33258 (10 ug/ml; UE, Suzhou, Čína) počas 5 minút a pozorovali sa pod fluorescenčným mikroskopom (Olympus Corporation, Tokio, Japonsko).
Myši sa rozdelili do štyroch skupín (n = 7 v každej skupine): (i) negatívna kontrolná skupina ošetrená PBS (len PBS; sondou 100 ul/myš PBS, po ktorej nasledovala denná intraperitoneálna injekcia 100 ul/myš PBS o 3 hodiny neskôr)., nepretržite počas 7 dní);(ii) negatívna kontrolná skupina liečená inhibítorom MCC950 [27] (100 ul/myš pomocou sondy PBS, o 3 hodiny neskôr, 10 mg/kg telesnej hmotnosti [BW] MCC950 [v PBS] sa podávalo intraperitoneálne denne, trvanie 7 dní);(iii) skupina s infekciou cysty G. duodenalis (1,5 x 106 cýst/myš sondou, o 3 hodiny neskôr, 100 ul/myš PBS intraperitoneálne podávané denne počas 7 dní);(iv) skupina s kombinovanou infekciou cysty G. duodenalis skupina liečená inhibítorom MCC950 (1,5 x 106 cýst/myš sondou, 10 mg/kg telesnej hmotnosti MCC950 intraperitoneálne denne počas 7 dní po 3 hodinách).Telesná hmotnosť každej myši bola monitorovaná denne a všetky myši boli usmrtené na 7. deň.Zozbieraný dvanástnik (3 cm dlhý) bol narezaný na malé kúsky v 1 ml PBS, cysty boli zničené cez noc v PBS pri 4 °C a G. duodenalis trophozoites.Čerstvý dvanástnik (1 cm dlhý) bol izolovaný na farbenie hematoxylínom a eozínom (H&E).
Myši boli rozdelené do dvoch skupín: (i) kontrolná skupina MOCK a (ii) skupina inhibítora MCC950.V každej skupine bolo päť ošetrení (n = 7/liečebná skupina): (i) negatívna kontrolná skupina na ošetrenie PBS (len PBS; 100 µl/myš PBS, intramuskulárna (IM) injekcia (tibialis anterior) [28, 29];( ii) pcDNA3.1(+) plazmidová negatívna kontrolná skupina (100 ug/myš DNA, intramuskulárnou injekciou); skupina liečená plazmidom pcDNA3.1(+)-alfa-2 (100 ug/myš DNA, intramuskulárnou injekciou) a (v) skupina liečená plazmidom pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 (100 ug/myš DNA, po 12 hodinách pasáže, myši v skupine s inhibítorom MCC950 dostávali denne intraperitoneálnu injekciu MCC950 (10 mg/kg telesnej hmotnosti) počas 7 dní, zatiaľ čo myši v skupine MOCK dostávali rovnaký objem liečby PBS. Vzorky krvi boli odobrané z očných buliev myší a ponechané cez noc pri 4 °C Vzorky séra sa izolovali pomocou enzýmového imunosorbentného testu (ELISA) na meranie hladín IL-1p.
Tridsaťpäť myší bolo rozdelených do piatich skupín (n=7/skupina).Skupina 1 bola negatívna kontrolná skupina liečená PBS: myši dostali 100 ul PBS intramuskulárne a o 3 dni neskôr sondou.Skupina 2 je pozitívna kontrolná skupina infikovaná cystami G. duodenalis: myšiam bolo injikovaných 100 ul PBS a o 3 dni neskôr bolo intragastricky injikovaných 1,5 x 106 cýst/myš.Tretia skupina – imunizácia plazmidom s pcDNA3.1(+) v kombinácii s kontrolnou skupinou na infekciu duodenálnych cyst: myši dostali 100 μg plazmidovej DNA pcDNA3.1(+)(im) perorálne, 1,5×106 cýst/myš 3 pre niekoľko dni.Skupiny 4 a 5 boli rekombinantný pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardinový plazmid alebo pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardinový plazmid v kombinácii s infekciou cysty G. duodenalis.Experimentálna skupina: myši dostali 100 ug pcDNA3.1(+)-giardínová plazmidová DNA (im), potom o 3 dni neskôr, 1,5 x 106 cýst/myš bolo injikovaných žalúdočnou sondou.Telesná hmotnosť každej myši sa monitorovala po zavedení cysty G. duodenalis cez skúmavku.Čerstvý duodenum sa odobral na meranie parazitickej záťaže a analýzu farbenia HE.
Histopatologické zmeny sa analyzovali podľa predtým publikovaného postupu [30].Čerstvý dvanástnik bol fixovaný fixačným prostriedkom tkanivových buniek, vložený do parafínu, narezaný na 4 μm rezy, zafarbený H&E a analyzovaný pod svetelným mikroskopom.Reprezentatívne patologické zmeny v siedmich tkanivových rezoch od siedmich nezávislých myší boli hodnotené patológom, ktorý nevedel o liečbe, a boli zachytené pri 200-násobnom zväčšení.Dĺžka klkov a hĺbka krýpt sa merali v súlade s vyššie opísanými metódami.
Výsledky in vitro a in vivo sa získali trojmo.Grafy boli vytvorené pomocou GraphPad Prism 7.00 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA).Rozdiely medzi dvoma skupinami sa analyzovali t-testom, zatiaľ čo rozdiely medzi ≥3 skupinami sa analyzovali jednosmernou analýzou rozptylu (ANOVA) s použitím softvéru SPSS (verzia 22.0; SPSS IBM Corp., Armonk, NY, USA).Dáta sa analyzovali na homogenitu rozptylu pomocou Leveneovho testu, po ktorom nasledoval Bonferroniho post hoc test (B).Významnosť je vyjadrená ako P<0,05, P<0,01 a P<0,001 (nevýznamné [ns]) (P>0,05).
Naša predchádzajúca analýza proteomiky GEV v Kjótskej encyklopédii génov a genómov (KEGG) ukázala, že na aktivácii zápalových signálnych dráh sa môže podieľať mnoho cieľov [13].Vybrali sme dva sľubné ciele, alfa-2 a alfa-7,3 giardiny, amplifikovali sme tieto molekuly a použili sme ich na konštrukciu eukaryotického expresného vektora pcDNA3.1(+).Po sekvenovaní boli rekombinantné plazmidy na expresiu pcDNA3.1(+)-alfa-2 a alfa-7.3 giardín transfekované do primárnych myších peritoneálnych makrofágov a identifikovaný zápalový proteín kaspázy-1 p20 (fragment aktivovanej kaspázy-1) ako objasnenie kľúčových molekúl, ktoré môžu spustiť zápal.Výsledky ukázali, že alfa-2 a alfa-7,3 giardiny môžu indukovať expresiu p20 kaspázy-1 podobnú GEV.Žiadny účinok na aktiváciu kaspázy-1 sa nezistil v neošetrenej negatívnej kontrole (len PBS) a plazmidovej kontrole pcDNA3.1(+) (obrázok 1).
Meranie aktivácie p20 kaspázy-1 pomocou pcDNA3.1(+)-alfa-2 a alfa-7.3 giardinov.Rekombinantné eukaryotické expresné plazmidy pcDNA3.1(+)-alfa-2 a alfa-7.3 giardines (nad každou dráhou) boli transfekované do primárnych myších peritoneálnych makrofágov a supernatanty kultúr boli zozbierané o 24 hodín neskôr.Western blotting sa použil na meranie hladín expresie signatúrneho zápalového proteínu kaspázy-1 p20.Ošetrená skupina len s PBS (dráha C) a skupina s monoterapiou pcDNA3.1(+) (pruh pcDNA3.1) sa použili ako negatívna kontrola a skupina liečená GEV sa použila ako pozitívna kontrola.Expresia rekombinantného proteínu bola potvrdená detekciou histidínovej značky v každom proteíne a očakávané proteínové pásy boli alfa-2 giardin (38,2 kDa) a alfa-7,3 giardin (37,2 kDa).GEV, extracelulárne vezikuly Giardia duodenum, pcDNA3.1(+), EcoRV-linearizovaný vektor, SUP, supernatant
Na určenie, či alfa-2 giardin a alfa-7,3 giardin indukujú expresiu p20 kaspázy-1 a hrajú úlohu pri aktivácii zápalovej reakcie hostiteľa NLRP3, pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardin a pcDNA3.1(+)-alfa -7.3 giardin bol transfekovaný do primárnych myších peritoneálnych makrofágov s rekombinantnou plazmidovou DNA a boli stanovené hladiny expresie, lokalizácie a oligomerizácie kľúčových zápalových proteínov NLRP3.V tomto experimente sa GEV použila ako pozitívna kontrolná skupina a skupina bez liečby (len PBS) alebo skupina s transfekciou pcDNA3.1(+) bola negatívnou skupinou.Výsledky ukázali, že rovnako ako v skupine GEV, rekombinantná plazmidová DNA giardin pcDNA3.1(+)-alfa-2 a giardin pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 viedla k upregulácii NLRP3, pro-IL-1p a aktivácia prokaspázy-1 a kaspázy-1 (obr. 2a).Okrem toho oba giardiny indukovali významnú sekréciu IL-1p (pcDNA3.1: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,1000; alfa-2 giardine: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,0007 ).;alfa-7,3 giardin: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P<0,0001;GEV: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,0047) (obrázok 2b).Väčšina ASC proteínov bola monomérna v neliečenej skupine alebo v liečenej skupine transfekovanej plazmidom pcDNA3.1(+), na rozdiel od pcDNA3.1(+)-alfa-2 alebo pcDNA3.1(+)-alfa- 7.3 giardina.ASC oligomerizácia sa vyskytla v rekombinantnej plazmidovej DNA GEV pozitívnej kontrolnej skupiny alebo skupiny, ktorá vykazovala oligomérnu formu (obrázok 2c).Tieto predbežné údaje naznačujú, že alfa-2 giardín a alfa-7,3 giardín môžu indukovať aktiváciu zápalu NLRP3.Následné imunofluorescenčné štúdie lokalizácie ASC a NLRP3 ukázali, že v negatívnej kontrolnej skupine bol proteín ASC rozptýlený v cytoplazme a objavil sa ako bodový signál po stimulácii pcDNA3.1(+)-alfa-2 pomocou giardinu alebo pcDNA3.1(+)-alfa-7,3 giardinová skupina alebo GEV pozitívna kontrolná skupina (obrázok 2d).V negatívnej kontrole a v skupinách pcDNA 3.1 ošetrených plazmidom sa signál proteínu NLRP3 nezistil, zatiaľ čo fluorescenčný signálny bod v reakcii na pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardin alebo pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 bolo zistené..giardin sa nachádzajú v cytoplazme alebo po stimulácii HEV (obr. 2e).Tieto údaje ďalej ukazujú, že G. duodenalis giardin alpha-2 a giardin alpha-7.3 aktivujú zápal NLRP3 v myších primárnych peritoneálnych makrofágoch.
pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardin a pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardin aktivujú zápal NLRP3 v myších peritoneálnych makrofágoch.Transfekujte rekombinantné eukaryotické expresné plazmidy pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardin a pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardin do primárnych myších peritoneálnych makrofágov a buniek alebo zozbierajte supernatant do 24 hodín na analýzu expresie, oligomerizáciu , sekrét.a lokalizácia kľúčových zápalových proteínov.Skupina len s PBS (C) a pcDNA3.1(+) jednotlivo liečená skupina sa použili ako negatívna kontrola a skupina liečená GEV sa použila ako pozitívna skupina.a Kľúčové zápalové proteíny NLRP3, vrátane NLRP3, pro-IL-1 p, pro-kaspázy-1 a p20 kaspázy-1, sa detegovali pomocou Western blottingu.b Hladiny sekrécie IL-1 p v supernatantoch sa stanovili pomocou enzýmového imunoanalýzy (ELISA).Rozdiely medzi kontrolnými a experimentálnymi skupinami boli analyzované jednosmernou analýzou rozptylu (ANOVA) s použitím softvéru SPSS verzie 22.0.Hviezdičky označujú významné rozdiely medzi skupinami **P<0,01 a ***P<0,001.c Úrovne oligomerizácie ASC v peletách sa určili analýzou zosieťovania DSS, zatiaľ čo hladiny ASC v bunkových lyzátoch sa použili ako kontrola nanášania.d Vizualizácia lokalizácie ISC pomocou imunofluorescencie.e Imunofluorescencia sa použila na vizualizáciu lokalizácie NLRP3.ASC, apoptotický škvrnitý proteín;IL, interleukín;NLRP3, nukleotid viažuci receptor podobný oligomerizácii 3;ns, nevýznamné (P > 0,05)
G. duodenalis aj GEV, ktoré vylučuje, aktivujú zápal NLRP3 a regulujú zápalové reakcie hostiteľa in vitro.Úloha zápalu NLRP3 v patogenite G. duodenalis teda zostáva nejasná.Na preskúmanie tohto problému sme navrhli experiment medzi myšami infikovanými cystou G. duodenalis a myšami infikovanými cystou G. duodenalis + liečbou inhibítorom MCC950 a porovnali sme expresiu zápalu NLRP3 pri infekcii cystou G. duodenalis.Podrobná schéma experimentu je znázornená na obr. 3a.Zmeny telesnej hmotnosti myší v rôznych liečebných skupinách sa monitorovali 7 dní po infekcii cystami a výsledky sú znázornené na obr. 3b.V porovnaní so skupinou liečenou čistým PBS výsledky ukázali, že (i) telesná hmotnosť myší infikovaných cystou G. duodenalis klesla od 3. do 7. dňa po infekcii;(ii) liečba inhibítorom MCC950 nemala žiadny významný vplyv na telesnú hmotnosť myší..V porovnaní so skupinou s jednou infekciou sa telesná hmotnosť skupiny s duodenálnou infekciou liečenej MCC950 znížila v rôznej miere (deň 1: ANOVA, F(3, 24) = 1,885, P = 0,0148; deň 2: ANOVA, F( 3, 24 ) = 0,4602, P<0,0001, deň 3: ANOVA, F(3, 24) = 0,8360, P = 0,0010; deň 4: ANOVA, F(3, 24) = 1,683; (3, 24) = 0,6497, P = 0,0645; Deň 6: ANOVA, F(3, 24) = 5,457, P = 0,0175;Tieto údaje ukazujú, že zápal NLRP3 chráni myši pred významným úbytkom hmotnosti v skorých štádiách (2-4 dni) duodenálnej infekcie.Potom sme sa zamerali na detekciu trofozoitov G. duodenalis v duodenálnej lavážnej tekutine a výsledky sú znázornené na obrázku 3c.V porovnaní so skupinou s infekciou cysty G. duodenalis sa počet trofozoitov v duodene významne zvýšil po blokovaní zápalu NLRP3 (t(12) = 2,902, P = 0,0133).Tkanivá dvanástnika zafarbené HE ukázali v porovnaní s negatívnou kontrolou ošetrenou samotným PBS a MCC950: (i) infekcia cysty G. duodenalis viedla k poškodeniu duodenálnych klkov (ANOVA, F(3, 24)=0,4903, P=0,0488 ) a atrofia krýpt (ANOVA, F(3, 24) = 0,4716, P = 0,0089);(ii) duodenum z myší infikovaných cystami G. duodenalis a liečených inhibítormi MCC950.duodenálne klky boli poškodené a mŕtve (ANOVA, F(3, 24) = 0,4903, P = 0,0144) s atrofiou a rozvetvením krýpt (ANOVA, F(3, 24) = 0,4716, P = 0, 0481) (obr. 3d- f) .Tieto výsledky naznačujú, že NLRP3 inflammasóm hrá úlohu pri znižovaní patogenity G. duodenalis.
Úloha zápalu NLRP3 pri infekcii Giardia duodenum.Myšiam sa podali sondou (iv) duodenokokové cysty a potom sa ošetrili s alebo bez MCC950 (ip).Jednotlivé liečebné skupiny s PBS alebo MCC950 sa použili ako kontroly.Experimentálna skupina a liečebný režim.b Telesná hmotnosť myší v každej z rôznych liečebných skupín sa monitorovala počas 7 dní.Rozdiel medzi skupinou s infekciou G. duodenalis a skupinou liečenou infekciou G. duodenalis + MCC950 sa analyzoval t-testom s použitím softvéru SPSS verzie 22.0.Hviezdičky označujú významné rozdiely pri *P<0,05, **P<0,01 alebo ***P<0,001.c Parazitická záťaž bola stanovená spočítaním počtu trofozoitov v duodenálnej lavážnej tekutine.Rozdiel medzi skupinou s infekciou G. duodenalis a skupinou liečenou infekciou G. duodenalis + MCC950 sa analyzoval t-testom s použitím softvéru SPSS verzie 22.0.Hviezdičky označujú významné rozdiely pri *P < 0,05.d Výsledky farbenia hematoxylínom a eozínom (H&E) duodenálnej histopatológie.Červené šípky označujú poškodenie klkov, zelené šípky označujú poškodenie krýpt.Mierka: 100 um.e, f Štatistická analýza výšky duodenálnych klkov a výšky krýpt myši.Hviezdičky označujú významné rozdiely pri *P<0,05 a **P<0,01.Výsledky sú prevzaté zo 7 nezávislých biologických experimentov.BW, telesná hmotnosť;ig, intragastrický spôsob podávania;ip, intraperitoneálna cesta podávania;ns, nevýznamné (P > 0,05);PBS, fyziologický roztok pufrovaný fosfátom;WT, divoký typ
Sekrécia IL-1p je charakteristickým znakom aktivácie zápalu.Aby sme určili, či G. duodenalis alfa-2 giardin a alpha-7,3 giardine aktivujú NLRP3 hostiteľský zápal in vivo, použili sme neliečené WT myši (simulovaná skupina) a myši blokované zápalom NLRP3 (liečebná skupina inhibovaná MCC950).Podrobná schéma experimentu je znázornená na obr. 4a.Experimentálne skupiny pozostávali z myší ošetrených PBS, ošetrenia cysty G. duodenalis sondou, intramuskulárnou injekciou pcDNA3.1 a intramuskulárnou injekciou pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardinu alebo pcDNA3.1-alfa-7.3 giardinu.Na 7. deň po intramuskulárnom podaní rekombinantného plazmidu sa odobralo sérum a stanovila sa hladina IL-lp v každej skupine.Ako je znázornené na obrázku 4b, v skupine MOCK: (i) v porovnaní so skupinou PBS nemalo ošetrenie pcDNA3.1 žiadny významný vplyv na sekréciu IL-1p (ANOVA, F(4,29)=4,062, P=0,9998), avšak Sekrécia IL-p bola významne zvýšená v skupine s cystou G. duodenalis (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P = 0,0002), (ii) pcDNA3.1-alfa-2 giardin a pcDNA3.1- Intramuskulárna injekcia alfa-7,3 giardinu významne zvýšila hladiny IL-1 p v sére (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P<0,0001);(iii) pcDNA3.1-alfa-7,3 giardín indukoval vysoké hladiny sekrécie IL-1p v skupine s intramuskulárnou injekciou pcDNA3.1-alfa-2 giardin (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P = 0,0333) .V porovnaní s každou skupinou v liečebnej skupine MCC950 a skupine MOCK: (i) hladiny sekrécie IL-1p v kontrolnej skupine PBS a kontrolnej skupine pcDNA3.1 sa po blokovaní inhibítora MCC950 do určitej miery znížili, ale rozdiel nebol významné (PBS: ANOVA, F (9, 58) = 3,540, P = 0,4912 pcDNA3.1: ANOVA, F(9, 58) = 3,540, P = 0,5949);(ii) po zablokovaní MCC950.sekrécia IL-1p bola významne znížená v skupine infikovanej cystou G. duodenalis, v skupine s pcDNA3.1-alfa-2 giardinom a v skupine s pcDNA3.1-alfa-7.3 giardinom (G. duodenalis: ANOVA, F(9) ,58) = 3,540, P = 0,0120 pcDNA3.1-alfa-2 giardin: ANOVA, F(9, 58) = 3,540, P = 0,0447; ) = 3,540, P = 0,0164).Tieto výsledky naznačujú, že alfa-2 giardín a alfa-7,3 giardín sprostredkúvajú aktiváciu zápalu NLRP3 in vivo.
pcDNA3.1(+)-giardiny aktivujú NLRP3 hostiteľský zápal in vivo.Myši boli imunizované (IM) rekombinantným eukaryotickým expresným plazmidom pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardin alebo pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardin a potom ošetrené MCC950 (ip; MCC950 skupina) alebo nie (fiktívna skupina ).Skupina liečená plazmidom PBS alebo pcDNA3.1(+) sa použila ako negatívna kontrola, skupina liečená cystou G. duodenalis sa použila ako pozitívna kontrola.Experimentálna skupina a liečebný režim.b Sérové ​​hladiny IL-1 p u myší sa merali v deň 7 testom ELISA.Rozdiely medzi skupinami v skupine MOCK sa analyzovali pomocou jednosmernej ANOVA a rozdiely medzi skupinou MOCK a skupinou MCC950 sa analyzovali pomocou t-testu softvéru SPSS verzie 22.0.Hviezdičky označujú významné rozdiely medzi liečebnými skupinami v skupine MOCK, *P<0,05 a ***P<0,001;znaky dolára ($) označujú významné rozdiely medzi každou skupinou v skupine MOCK a skupinou MCC950 pri P<0,05.Výsledky siedmich nezávislých biologických experimentov.i, intramuskulárna injekcia, ns, nevýznamné (P > 0,05)
Aby sme preskúmali účinok aktivácie hostiteľského zápalu NLRP3 sprostredkovanej alfa-2 a alfa-7,3 giardinom na infekčnosť G. duodenalis, použili sme myši WT C57BL/6 a vstrekli sme alfa-2 giardin a alfa-7,3 giardin.plazmid bol intramuskulárne injikovaný po 3 dňoch cez žalúdočnú sondu cysty G. duodenalis, potom boli myši pozorované počas 7 dní.Podrobná schéma experimentu je znázornená na obr. 5a.Telesná hmotnosť každej myši sa merala každý deň, vzorky čerstvého duodenálneho tkaniva sa odoberali na 7. deň po podaní žalúdočnou sondou, meral sa počet trofozoitov a pozorovali sa histopatologické zmeny.Ako je znázornené na obrázku 5b, so zvyšujúcim sa časom kŕmenia sa telesná hmotnosť myší v každej skupine postupne zvyšovala.MT myší sa začala znižovať na 3. deň po intragastrickom podaní cýst G. duodenalis a potom sa postupne zvyšovala.Aktivácia zápalu NLRP3 indukovaná intramuskulárnou injekciou alfa-2 giardinu a alpha7.3 giardinu významne zmiernila úbytok hmotnosti u myší (deň 1: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 1,399, P = 0,9754 Deň 1: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardin, ANOVA, F(4, 30)=1.399, P=0.9987 Deň 2: pcDNA3.1-alfa-2 giardin, ANOVA, F(4, 30) = 0,3172, P = 0,9979; deň 2: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardin, ANOVA, F(4, 30) = 0,3172, P = 0,8409; 4, 30) = 0,8222, P = 0,0262 Deň 3: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardin, ANOVA, F(4, 30) = 0.8222, P = 0.0083 Deň 4: pcDNA3.1-alfa-2 , F(4, 30) = 0,5620, P = 0,0012, Deň 4: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardin, ANOVA, F(4, 30) = 0,5620, P < 0,0001, Deň 5: pcDNA3.1-alpha 2 giardina, ANOVA, F(4, 30) = 0,9728, P < 0,0001 Deň 5: pcDNA3.1-alfa-7,3 giardina, ANOVA, F(4, 30) = 0,9728, P < 0,0001 Deň 6: -1 ks alfa-2 giardin, ANOVA, F(4, 30) = 0,7154, P = 0,0012, deň 6: pcDNA3.1-alfa-7,3 giardin, ANOVA, F(4, 30) = 0,7154, P = 0,0006;Deň 7: pcDNA3.1-alfa-2 giardin, ANOVA, F(4, 30) = 0,5369, P<0,0001 Deň 7: pcDNA3.1-alfa-7,3 giardin, ANOVA, F(4, 30) = 0,5369, P <0,0001).Parazitická záťaž bola hodnotená v duodene (obr. 5c).V porovnaní s neošetrenou pozitívnou kontrolou a skupinou, ktorej bol injikovaný prázdny vektor pcDNA3.1, bol počet trofozoitov G. duodenalis významne znížený v skupinách, ktorým bol injekčne podaný α-2 giardin a α-7,3 giardin (pcDNA3.1-alfa -2 giardin: ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P = 0,0002, pcDNA3.1-alfa-7.3 giardin: ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P < 0,0001).Okrem toho giardín alfa-7,3 mal väčšiu ochranu u myší ako giardín alfa-2 (ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P = 0,0081).Výsledky farbenia HE sú znázornené na obr.5d – f.Myši, ktorým bol injikovaný alfa-2 giardin a alfa-7,3 giardin, mali menej lézií tkaniva dvanástnika, prejavujúcich sa poškodením klkov, v porovnaní s myšami, ktorým bol injikovaný G. duodenalis a myšami, ktorým bol injikovaný G. duodenalis v kombinácii s prázdnym vektorom pcDNA3 0,1 Zoom.(pcDNA3.1-alfa-2 giardin: ANOVA, F(3, 24) = 2,466, P = 0,0035 alebo P = 0,0068; pcDNA3.1-alfa-7,3 giardin: ANOVA, F(3, 24) = 2,466, P = 0,0028 alebo P = 0,0055) a znížená atrofia krýpt (pcDNA3.1-alfa-2 giardín: ANOVA, F(3, 24) = 1,470, P = 0,0264 alebo P = 0,0158; pcDNA3.1-alfa-2 giardín: 7,3 F(3,24) = 1,470, P = 0,0371 alebo P = 0,0191).Tieto výsledky naznačujú, že alfa-2 giardin a alfa-7,3 giardin znižujú infekčnosť G. duodenalis aktiváciou zápalu NLRP3 in vivo.
Úloha pcDNA3.1(+)-giardinov pri infekcii G. duodenalis.Myši boli imunizované (IM) rekombinantnými eukaryotickými expresnými plazmidmi pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardin alebo pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardin a potom stimulované cystami G. duodenalis (ig).Skupina PBS a skupina liečená pcDNA3.1(+)+ duodenálnou cystou boli použité ako negatívne kontrolné skupiny a skupina liečená duodenálnymi cystami bola použitá ako pozitívna kontrolná skupina.Experimentálna skupina a liečebný režim.b MT myší v každej z rôznych liečebných skupín sa monitorovala 7 dní po stimulácii.Hviezdičky označujú významné rozdiely medzi skupinami v skupine G. duodenalis a pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardinovej skupine, *P < 0,05, **P < 0,01 a ***P < 0,001;znak dolára ($) označuje významný rozdiel medzi každou skupinou G. duodenalis a skupinou pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 jardine, $$P<0,01 a $$$P<0,001.c Parazitická záťaž bola stanovená spočítaním počtu trofozoitov v 1 ml duodenálnej laváže z dvanástnika (3 cm dlhá) a vyjadrená ako počet parazitov na cm dvanástnika.Rozdiely medzi infekčnou skupinou G. duodenalis, pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardínovou skupinou a pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardínovou skupinou boli analyzované jednosmernou ANOVA s použitím SPSS softvérovej verzie 22.0.Hviezdičky označujú významné rozdiely pri **P<0,01 a ***P<0,001.d Histopatologické zmeny v dvanástniku.Červené šípky označujú poškodenie klkov, zelené šípky označujú poškodenie krýpt.Mierka: 100 um.e, f Štatistická analýza výšky duodenálnych klkov myší (e) a výšky krypty (f).Rozdiely medzi skupinami na obrázku 1d boli analyzované jednosmernou ANOVA s použitím softvéru SPSS verzie 22.0.Hviezdičky označujú významné rozdiely pri *P<0,05 a **P<0,01.Výsledky siedmich nezávislých biologických experimentov.ns, nevýznamné (P > 0,05)
Giardia duodenum je dobre známy črevný parazit ľudí a iných cicavcov, ktorý spôsobuje giardiázu.V roku 2004 bola zaradená do Iniciatívy WHO pre zanedbané choroby kvôli jej vysokej prevalencii počas 6 rokov, najmä v komunitách s nízkym socioekonomickým statusom [32].Vrodený imunitný systém hrá rozhodujúcu úlohu v imunitnej odpovedi na infekciu G. duodenalis.Uvádza sa, že myšacie makrofágy pohlcujú a zabíjajú G. duodenalis uvoľnením extracelulárnych pascí [33].Naše predchádzajúce štúdie ukázali, že G. duodenalis, neinvazívny extracelulárny parazit, aktivuje zápalové signálne dráhy p38 MAPK, ERK, NF-κB p65 a NLRP3 v myších makrofágoch na reguláciu zápalových reakcií hostiteľa a uvoľnený GEV môže tento proces posilniť.13], 24].Presné PAMP zapojené do zápalu regulovaného zápalom NLRP3 v GEV a úloha zápalu NLRP3 pri giardiáze však zostáva ešte objasniť.Aby sme objasnili tieto dve otázky, uskutočnili sme túto štúdiu.
Inflammasóm NLRP3 sa nachádza v cytoplazme imunitných buniek a môže byť aktivovaný rôznymi časticami, ako sú kryštály kyseliny močovej, toxíny, baktérie, vírusy a parazity.V bakteriálnych štúdiách boli toxíny identifikované ako kľúčové PAMP, ktoré aktivujú zápalové senzory, čo vedie k zápalu a bunkovej smrti [34].Niektoré štrukturálne rôznorodé toxíny, ako napríklad hemolyzín zo Staphylococcus aureus [35] a Escherichia coli [36], hemolyzín BL (HBL) z enterotoxínu (NHE) [37], indukujú aktiváciu zápalu NLRP3.Vírusové štúdie ukázali, že proteíny virulencie, ako je obalový proteín (E) SARS-COV-2 [38] a proteín NS5 vírusu Zika [39], sú dôležité PAMP rozpoznávané receptorom NLRP3.V štúdiách parazitov sa uvádza, že mnohé parazity sú spojené s aktiváciou zápalu hostiteľa, ako napríklad Toxoplasma gondii, Trichomonas vaginalis [40], Trypanosoma cruzi [41] a Leishmania [42].Husté granulované proteíny GRA35, GRA42 a GRA43 spojené s virulenciou Toxoplasma gondii sú potrebné na vyvolanie pyroptózy v makrofágoch potkanov Lewis [43].Okrem toho sa niektoré štúdie Leishmania zamerali na jednotlivé molekuly zapojené do zápalu NLRP3, ako je lipofosfoglykán s membránou parazita [44] alebo metaloproteáza zinku [45].Spomedzi génov rodiny alfa-giardinov podobných anexínu sa alpha-1 giardin ukázal ako potenciálny kandidát na vakcínu poskytujúcu ochranu proti G. duodenalis na myšom modeli [18].V našej štúdii sme vybrali faktory virulencie G. duodenalis alpha-2 a alpha-7,3 giardines, ktoré sú jedinečné pre Giardia, ale relatívne menej hlásené.Tieto dva cieľové gény sa klonovali do vektora eukaryotického expresného systému pcDNA3.1(+) na analýzu aktivácie zápalu.
V našom myšacom modeli slúžia štiepené fragmenty kaspázy ako markery zápalovej aktivácie.Po stimulácii NLRP3 interaguje s ASC, získava prokaspázy a vytvára aktívne kaspázy, ktoré štiepia pro-IL-1p a pro-IL-18 na zrelý IL-1p a IL-18, v tomto poradí -18.Zápalové kaspázy (kaspázy-1, -4, -5 a -11) sú konzervovanou rodinou cysteínových proteáz, ktoré sú kritické pre vrodenú obranu a podieľajú sa na zápale a programovanej bunkovej smrti [46].Kaspáza-1 je aktivovaná kanonickými zápalmi [47], zatiaľ čo kaspázy-4, -5 a -11 sa štiepia pri tvorbe atypických zápalov [48].V tejto štúdii sme použili myšie peritoneálne makrofágy ako model a skúmali sme kaspázu-1 štiepenú p20 kaspázou-1 ako marker aktivácie zápalu hostiteľa NLRP3 v štúdiách infekcie G. duodenalis.Výsledky ukázali, že mnoho alfa-giardinov je zodpovedných za typickú aktiváciu zápalu, čo je v súlade s objavom kľúčových virulentných molekúl zapojených do baktérií a vírusov.Naša štúdia je však len predbežným skríningom a existujú aj iné molekuly, ktoré môžu aktivovať neklasické zápaly, keďže naša predchádzajúca štúdia zistila klasické aj neklasické zápaly pri infekcii G. duodenalis [13].Aby sme ďalej určili, či je vygenerovaná p20 kaspáza-1 spojená s zápalom NLRP3, transfekovali sme alfa-2 a alfa-7,3 giardiny do myších peritoneálnych makrofágov, aby sme určili hladiny expresie proteínov kľúčových molekúl a úrovne oligomerizácie ASC, čo potvrdzuje, že obe a-giardiny sa aktivujú. zápalový NLRP3.Naše výsledky sa mierne líšia od výsledkov Manko-Prykhoda et al., ktorí uviedli, že stimulácia buniek Caco-2 samotnými kmeňmi G. muris alebo E. coli EPEC môže zvýšiť intenzitu fluorescencie NLRP3, ASC a kaspázy-1, hoci nie signifikantne, kým kostimulácia G. muris a E. coli zvýšila hladiny troch proteínov [49].Tento nesúlad môže byť spôsobený rozdielmi vo výbere druhov Giardia, bunkových línií a primárnych buniek.Uskutočnili sme aj in vivo testy s použitím MCC950 u 5-týždňových samíc myší WT C57BL/6, ktoré sú náchylnejšie na G. duodenalis.MCC950 je silný a selektívny inhibítor NLRP3 s malou molekulou, ktorý blokuje kanonickú a nekanonickú aktiváciu NLRP3 v nanomolárnych koncentráciách.MCC950 inhibuje aktiváciu NLRP3, ale neovplyvňuje aktiváciu zápalových dráh AIM2, NLRC4 a NLRP1 alebo signálnych dráh TLR [27].MCC950 blokuje aktiváciu NLRP3, ale neinhibuje iniciáciu NLRP3, eflux K+, tok Ca2+ alebo interakciu medzi NLRP3 a ASC;namiesto toho inhibuje aktiváciu zápalu NLRP3 blokovaním oligomerizácie ASC [27].Preto sme použili MCC950 v štúdii in vivo na určenie úlohy zápalu NLRP3 po injekcii giardinu.Aktivovaná kaspáza-1 p10 štiepi prozápalové cytokíny pro-IL-1β a pro-IL-18 na zrelý IL-1β a IL-18 [50].V tejto štúdii sa hladiny IL-1 p v sére u myší liečených giardínom s alebo bez MCC950 použili ako indikátor toho, či bol aktivovaný zápal NLRP3.Ako sa očakávalo, liečba MCC950 významne znížila hladiny IL-1 p v sére.Tieto údaje jasne demonštrujú, že G. duodenalis giardin alfa-2 a giardin alfa-7.3 sú schopné aktivovať zápal myši NLRP3.
Významné údaje nazhromaždené za posledné desaťročie ukázali, že IL-17A je hlavným regulátorom imunity proti G. muris, ktorý indukuje signalizáciu IL-17RA, produkuje antimikrobiálne peptidy a reguluje aktiváciu komplementu [51].Infekcia Giardia sa však vyskytuje častejšie u mladých dospelých a bolo hlásené, že infekcia Giardia u mladých myší neaktivuje odpoveď IL-17A, aby uplatnila svoj ochranný účinok [52], čo podnietilo výskumníkov, aby hľadali iné imunomodulačné Giardie.mechanizmy helmintovej infekcie.Autori nedávnej štúdie uviedli, že G. muris môže aktivovať zápal NLRP3 prostredníctvom E. coli EPEC, ktorý podporuje produkciu antimikrobiálnych peptidov a znižuje jeho schopnosť pripojenia a počet trofozoitov v črevnom trakte, čím sa znižuje závažnosť hrubého čreva choroby spôsobené bacilom [49•].Inflammasóm NLRP3 sa podieľa na vzniku rôznych chorôb.Štúdie ukázali, že Pseudomonas aeruginosa spúšťa autofágiu v makrofágoch, aby sa zabránilo bunkovej smrti, a tento proces závisí od aktivácie zápalu NLRP3 [53].V prípade N. caninum aktivácia zápalu NLRP3 sprostredkovaná reaktívnymi druhmi kyslíka obmedzuje jeho replikáciu v hostiteľovi, čo z neho robí potenciálny terapeutický cieľ [9].Zistilo sa, že Paracoccidioides brasiliensis indukuje aktiváciu zápalu NLRP3 v dendritických bunkách odvodených od kostnej drene myší, čo vedie k uvoľneniu zápalového cytokínu IL-1β, ktorý hrá rozhodujúcu úlohu v obrane hostiteľa [10].Niekoľko druhov Leishmania, vrátane L. amazonensis, L. major, L. braziliensis a L. infantum chagasi, aktivuje NLRP3 a ASC-dependentnú kaspázu-1 v makrofágoch, ako aj infekciu Leishmania.Replikácia parazitov je zvýšená u myší s deficitom génu NLRP3/ASC/kaspáza-1 [11].Zamboni a kol.Bolo hlásené, že infekcia Leishmania indukuje aktiváciu zápalu NLRP3 v makrofágoch, čo obmedzuje intracelulárnu replikáciu parazitov.Leishmania teda môže inhibovať aktiváciu NLRP3 ako stratégiu vyhýbania sa.V in vivo štúdiách zápal NLRP3 prispel k eliminácii Leishmania, ale neovplyvnil tkanivá [54].Naopak, v štúdiách helmintiázy aktivácia zápalu NLRP3 potlačila ochrannú imunitu hostiteľa proti gastrointestinálnej helmintiáze [12].Shigella je jednou z hlavných baktérií spôsobujúcich hnačku na celom svete.Tieto baktérie môžu indukovať produkciu IL-1p prostredníctvom efluxu K+ sprostredkovaného receptorom P2X7, reaktívnych foriem kyslíka, acidifikácie lyzozómov a poškodenia mitochondrií.Inflammasóm NLRP3 negatívne reguluje fagocytózu a baktericídnu aktivitu makrofágov proti Shigella [55].Štúdie Plasmodium ukázali, že myši s deficitom AIM2, NLRP3 alebo kaspázy-1 infikované Plasmodium produkujú vysoké hladiny interferónu typu 1 a sú odolnejšie voči infekcii Plasmodium [56].Úloha alfa-2 giardínu a alfa-7,3 giardinu pri indukcii patogénnej aktivácie zápalu NLRP3 u myší je však nejasná.
V tejto štúdii inhibícia zápalu NLRP3 pomocou MCC950 znížila BW a zvýšila počet trofozoitov v črevnej výplachovej tekutine u myší, čo viedlo k závažnejším patologickým zmenám v duodenálnom tkanive.Alfa-2 giardin a alpha-7,3 giardin aktivujú hostiteľský myšací zápal NLRP3, zvyšujú telesnú hmotnosť myši, znižujú počet trofozoitov v intestinálnej výplachovej tekutine a zmierňujú patologické dvanástnikové lézie.Tieto výsledky naznačujú, že G. duodenalis môže aktivovať zápal hostiteľa NLRP3 prostredníctvom alfa-2 giardínu a alfa-7,3 giardinu, čím sa znižuje patogenita G. duodenalis u myší.
Súhrnne naše výsledky ukazujú, že alfa-2 a alfa-7,3 giardiny indukujú aktiváciu NLRP3 hostiteľského zápalu a znižujú infekčnosť G. duodenalis u myší.Preto sú tieto molekuly sľubnými cieľmi na prevenciu giardiázy.
       Data supporting the results of this study can be obtained from the respective author at gongpt@jlu.edu.cn.
Liang AKS, Liang AAM, Huang AHC, Sergi KM, Kam JKM.Giardiáza: prehľad.Nedávno sa ukázalo, že Pat Inflamm je alergický na lieky.2019;13:134–43.
Escobedo AA, Tsimerman S. Giardiasis: prehľad farmakoterapie.Odborný posudok lekárnika.2007;8: 1885-902.
Tian Huafeng, Chen Bin, Wen Jianfeng.Giardiáza, lieková rezistencia a objavovanie nových cieľov.Infikuje liečivé ciele poruchy.2010;10:295–302.
Wang Z, Zhang X, Xiao Yi, Zhang W, Wu X, Qin T atď. Zápalové a zápalové ochorenia NLRP3.Oxide Med Cell Longev.2020;2020:4063562.
Chen GY, Núñez G. Úloha zápalu pri črevnom zápale a rakovine.Gastroenterológia.2011;141:1986-99.
Pellegrini C, Antonioli L, Lopez-Castejon G, Blandizzi C, Fornai M. Kanonická a atypická aktivácia zápalu NLRP3 na križovatke imunitnej tolerancie a zápalu čriev.preimunitné.2017;8:36.
Li L, Wang XC, Gong PT, Zhang N, Zhang X, Li S a kol.Aktivácia zápalu NLRP3 sprostredkovaná ROS sa podieľa na reakcii na infekciu N. caninum.Parazitový vektor.2020;13:449.