Ďakujeme, že ste navštívili Nature.com.Verzia prehliadača, ktorú používate, má obmedzenú podporu CSS.Pre najlepší zážitok vám odporúčame použiť aktualizovaný prehliadač (alebo vypnúť režim kompatibility v programe Internet Explorer).Medzitým, aby sme zabezpečili nepretržitú podporu, vykreslíme stránku bez štýlov a JavaScriptu.
Génové vektory na liečbu pľúcnej cystickej fibrózy musia byť zamerané na vodivé dýchacie cesty, pretože periférna pľúcna transdukcia nemá žiadny terapeutický účinok.Účinnosť vírusovej transdukcie priamo súvisí s dobou zotrvania nosiča.Avšak dodávacie tekutiny, ako sú nosiče génov, prirodzene difundujú do alveol počas inhalácie a terapeutické častice akéhokoľvek tvaru sú rýchlo odstránené mukociliárnym transportom.Predĺženie doby zotrvania génových nosičov v dýchacom trakte je dôležité, ale ťažko dosiahnuteľné.Magnetické častice konjugované s nosičom, ktoré môžu byť nasmerované na povrch dýchacieho traktu, môžu zlepšiť regionálne zacielenie.Kvôli problémom so zobrazovaním in vivo je správanie takýchto malých magnetických častíc na povrchu dýchacích ciest v prítomnosti aplikovaného magnetického poľa málo pochopené.Cieľom tejto štúdie bolo použiť synchrotrónové zobrazovanie na vizualizáciu in vivo pohybu série magnetických častíc v priedušnici anestetizovaných potkanov s cieľom študovať dynamiku a vzorce správania jednotlivých a hromadných častíc in vivo.Potom sme tiež zhodnotili, či by dodanie lentivírusových magnetických častíc v prítomnosti magnetického poľa zvýšilo účinnosť transdukcie v priedušnici potkana.Synchrotrónové röntgenové zobrazovanie ukazuje správanie magnetických častíc v stacionárnych a pohyblivých magnetických poliach in vitro a in vivo.Častice sa nedajú jednoducho ťahať po povrchu živých dýchacích ciest pomocou magnetov, no pri transporte sa usadeniny sústreďujú v zornom poli, kde je magnetické pole najsilnejšie.Účinnosť transdukcie sa tiež šesťnásobne zvýšila, keď boli lentivírusové magnetické častice dodávané v prítomnosti magnetického poľa.Celkovo tieto výsledky naznačujú, že lentivírusové magnetické častice a magnetické polia môžu byť cennými prístupmi na zlepšenie zacielenia génových vektorov a úrovní transdukcie vo vodivých dýchacích cestách in vivo.
Cystická fibróza (CF) je spôsobená variáciami v jedinom géne nazývanom CF regulátor transmembránovej vodivosti (CFTR).Proteín CFTR je iónový kanál, ktorý je prítomný v mnohých epiteliálnych bunkách v tele, vrátane dýchacích ciest, čo je hlavné miesto v patogenéze cystickej fibrózy.Poruchy CFTR vedú k abnormálnemu transportu vody, dehydratácii povrchu dýchacích ciest a zníženiu hĺbky povrchovej vrstvy tekutiny dýchacích ciest (ASL).Zhoršuje tiež schopnosť mukociliárneho transportného systému (MCT) vyčistiť dýchacie cesty od vdýchnutých častíc a patogénov.Naším cieľom je vyvinúť lentivírusovú (LV) génovú terapiu na dodanie správnej kópie génu CFTR a zlepšenie zdravia ASL, MCT a pľúc a pokračovať vo vývoji nových technológií, ktoré dokážu merať tieto parametre in vivo1.
LV vektory sú jedným z popredných kandidátov na génovú terapiu cystickej fibrózy, hlavne preto, že dokážu trvalo integrovať terapeutický gén do bazálnych buniek dýchacích ciest (kmeňové bunky dýchacích ciest).To je dôležité, pretože môžu obnoviť normálnu hydratáciu a odstraňovanie hlienu diferenciáciou na funkčné génovo upravené povrchové bunky dýchacích ciest spojené s cystickou fibrózou, čo má za následok celoživotné výhody.LV vektory musia byť nasmerované proti vodivým dýchacím cestám, pretože tu začína postihnutie pľúc pri CF.Podanie vektora hlbšie do pľúc môže viesť k alveolárnej transdukcii, čo však nemá žiadny terapeutický účinok pri cystickej fibróze.Tekutiny, ako sú nosiče génov, však pri vdýchnutí po pôrode prirodzene migrujú do alveol3,4 a terapeutické častice sú rýchlo vypudzované do ústnej dutiny pomocou MCT.Účinnosť transdukcie LV priamo súvisí s dĺžkou času, počas ktorého vektor zostáva blízko cieľových buniek, aby sa umožnilo bunkové vychytávanie – „doba pobytu“5, ktorá sa ľahko skracuje typickým regionálnym prúdením vzduchu, ako aj koordinovaným vychytávaním hlienu a častíc MCT.Pri cystickej fibróze je schopnosť predĺžiť dobu zotrvania ĽK v dýchacích cestách dôležitá na dosiahnutie vysokých úrovní transdukcie v tejto oblasti, ale doteraz bola náročná.
Na prekonanie tejto prekážky navrhujeme, aby magnetické častice LV (MP) mohli pomôcť dvoma komplementárnymi spôsobmi.Po prvé, môžu byť vedené magnetom na povrch dýchacích ciest, aby sa zlepšilo zacielenie a pomohli časticiam nosiča génov byť v správnej oblasti dýchacích ciest;a ASL) sa presúvajú do bunkovej vrstvy 6. MP sú široko používané ako cielené nosiče liekov, keď sa viažu na protilátky, chemoterapeutické lieky alebo iné malé molekuly, ktoré sa viažu na bunkové membrány alebo sa viažu na ich príslušné receptory na povrchu buniek a akumulujú sa v miestach nádoru prítomnosť statickej elektriny.Magnetické polia na terapiu rakoviny 7. Iné „hypertermické“ metódy sú zamerané na zabíjanie nádorových buniek zahrievaním MP, keď sú vystavené oscilujúcim magnetickým poliam.Princíp magnetickej transfekcie, pri ktorej sa magnetické pole používa ako transfekčné činidlo na zvýšenie prenosu DNA do buniek, sa bežne používa in vitro pomocou radu nevírusových a vírusových génových vektorov pre ťažko transdukovateľné bunkové línie. ..Bola stanovená účinnosť magnetotransfekcie LV s dodaním LV MP in vitro do bunkovej línie ľudského bronchiálneho epitelu v prítomnosti statického magnetického poľa, čím sa účinnosť transdukcie zvýšila 186-krát v porovnaní so samotným LV vektorom.LV MT bol tiež aplikovaný na in vitro model cystickej fibrózy, kde magnetická transfekcia zvýšila LV transdukciu v kultúrach na rozhraní vzduch-kvapalina faktorom 20 v prítomnosti spúta s cystickou fibrózou10.Magnetotransfekcii orgánov in vivo sa však venovala relatívne malá pozornosť a bola hodnotená len v niekoľkých štúdiách na zvieratách11,12,13,14,15, najmä v pľúcach16,17.Možnosti magnetickej transfekcie v pľúcnej terapii pri cystickej fibróze sú však jasné.Tan a kol.(2020) uviedli, že „validačná štúdia o účinnom pulmonálnom podávaní magnetických nanočastíc pripraví pôdu pre budúce stratégie inhalácie CFTR na zlepšenie klinických výsledkov u pacientov s cystickou fibrózou“6.
Správanie malých magnetických častíc na povrchu dýchacieho traktu v prítomnosti aplikovaného magnetického poľa je ťažké vizualizovať a študovať, a preto je zle pochopené.V iných štúdiách sme vyvinuli metódu synchrotrónového šírenia fázového kontrastného röntgenového zobrazovania (PB-PCXI) na neinvazívne zobrazovanie a kvantifikáciu minútových zmien in vivo v hĺbke ASL18 a správaní MCT1920 na priame meranie povrchovej hydratácie plynového kanála. a používa sa ako včasný indikátor účinnosti liečby.Okrem toho naša metóda hodnotenia MCT využíva častice s priemerom 10–35 µm zložené z oxidu hlinitého alebo skla s vysokým indexom lomu ako značky MCT viditeľné pomocou PB-PCXI21.Obe metódy sú vhodné na zobrazovanie radu typov častíc vrátane MP.
Vďaka vysokému priestorovému a časovému rozlíšeniu sú naše testy ASL a MCT založené na PB-PCXI veľmi vhodné na štúdium dynamiky a vzorcov správania jednotlivých a hromadných častíc in vivo, aby nám pomohli pochopiť a optimalizovať metódy dodávania génov MP.Prístup, ktorý tu používame, je založený na našich štúdiách s použitím lúčovej línie SPring-8 BL20B2, v ktorej sme vizualizovali pohyb tekutiny po podaní dávky fiktívneho vektora do nosných a pľúcnych dýchacích ciest myší, aby sme pomohli vysvetliť naše pozorované heterogénne vzorce génovej expresie. v našom géne.štúdie na zvieratách s dávkou nosiča 3,4.
Cieľom tejto štúdie bolo použiť synchrotrón PB-PCXI na vizualizáciu in vivo pohybov série MP v priedušnici živých potkanov.Tieto zobrazovacie štúdie PB-PCXI boli navrhnuté tak, aby testovali sériu MP, silu magnetického poľa a umiestnenie, aby sa určil ich účinok na pohyb MP.Predpokladali sme, že vonkajšie magnetické pole pomôže dodanej MF zostať alebo sa presunúť do cieľovej oblasti.Tieto štúdie nám tiež umožnili určiť konfigurácie magnetov, ktoré maximalizujú množstvo častíc, ktoré zostali v priedušnici po uložení.V druhej sérii štúdií sme sa zamerali na použitie tejto optimálnej konfigurácie na demonštráciu transdukčného vzoru vyplývajúceho z in vivo dodania LV-MP do dýchacích ciest potkana za predpokladu, že dodanie LV-MP v kontexte cielenia dýchacích ciest by viedlo k pri zvýšenej účinnosti transdukcie ĽK..
Všetky štúdie na zvieratách sa uskutočnili v súlade s protokolmi schválenými Univerzitou v Adelaide (M-2019-060 a M-2020-022) a Etickým výborom pre synchrotrónové zvieratá SPring-8.Experimenty sa uskutočnili v súlade s odporúčaniami ARRIVE.
Všetky röntgenové snímky boli urobené na lúčovej línii BL20XU na synchrotróne SPring-8 v Japonsku s použitím nastavenia podobného tomu, ktoré bolo opísané vyššie21,22.Stručne povedané, experimentálny box bol umiestnený 245 m od prstenca uloženia synchrotrónu.Vzdialenosť medzi vzorkou a detektorom 0,6 m sa používa na štúdie zobrazovania častíc a 0,3 m na štúdie zobrazovania in vivo na vytvorenie efektov fázového kontrastu.Použil sa monochromatický lúč s energiou 25 keV.Obrázky sa získali pomocou röntgenového prevodníka s vysokým rozlíšením (SPring-8 BM3) spojeného s detektorom sCMOS.Prevodník konvertuje röntgenové lúče na viditeľné svetlo pomocou scintilátora s hrúbkou 10 µm (Gd3Al2Ga3O12), ktorý sa potom nasmeruje na snímač sCMOS pomocou objektívu mikroskopu ×10 (NA 0,3).Detektor sCMOS bol Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japonsko) s veľkosťou poľa 2048 × 2048 pixelov a surovou veľkosťou pixelov 6,5 × 6,5 µm.Toto nastavenie poskytuje efektívnu veľkosť izotropných pixelov 0,51 µm a zorné pole približne 1,1 mm × 1,1 mm.Trvanie expozície 100 ms bolo zvolené tak, aby sa maximalizoval pomer signálu k šumu magnetických častíc vo vnútri a mimo dýchacích ciest a zároveň sa minimalizovali pohybové artefakty spôsobené dýchaním.Pre štúdie in vivo bola do dráhy röntgenového žiarenia umiestnená rýchla röntgenová uzávierka, aby sa obmedzila dávka žiarenia blokovaním röntgenového lúča medzi expozíciami.
Médium LV nebolo použité v žiadnych zobrazovacích štúdiách SPring-8 PB-PCXI, pretože zobrazovacia komora BL20XU nemá certifikáciu úrovne biologickej bezpečnosti 2.Namiesto toho sme vybrali rad dobre charakterizovaných MP od dvoch komerčných predajcov pokrývajúcich celý rad veľkostí, materiálov, koncentrácií železa a aplikácií, — najprv s cieľom pochopiť, ako magnetické polia ovplyvňujú pohyb MP v sklenených kapilárach, a potom v živé dýchacie cesty.povrch.Veľkosť MP sa pohybuje od 0,25 do 18 um a je vyrobená z rôznych materiálov (pozri tabuľku 1), ale zloženie každej vzorky, vrátane veľkosti magnetických častíc v MP, nie je známe.Na základe našich rozsiahlych štúdií MCT 19, 20, 21, 23, 24 očakávame, že MP do 5 µm možno vidieť na povrchu tracheálnych dýchacích ciest, napríklad odčítaním po sebe idúcich snímok, aby sme videli lepšiu viditeľnosť pohybu MP.Jediný MP 0,25 um je menší ako rozlíšenie zobrazovacieho zariadenia, ale očakáva sa, že PB-PCXI bude detekovať ich objemový kontrast a pohyb povrchovej kvapaliny, na ktorej sú uložené po nanesení.
Vzorky pre každého poslanca v tabuľke.1 bol pripravený v 20 μl sklenených kapilárach (Drummond Microcaps, PA, USA) s vnútorným priemerom 0,63 mm.Korpuskulárne častice sú dostupné vo vode, zatiaľ čo častice CombiMag sú dostupné vo vlastnej kvapaline výrobcu.Každá skúmavka je do polovice naplnená kvapalinou (približne 11 µl) a umiestnená na držiak vzorky (pozri obrázok 1).Sklenené kapiláry sa umiestnili horizontálne na stolík v zobrazovacej komore a umiestnili sa na okraje kvapaliny.Nikel-plášťový magnet s priemerom 19 mm (28 mm dlhý) vyrobený zo vzácnych zemín, neodýmu, železa a bóru (NdFeB) (N35, kat. č. LM1652, Jaycar Electronics, Austrália) s remanenciou 1,17 T bol pripevnený k samostatný prenosový stôl na dosiahnutie Diaľkovo zmeňte svoju polohu počas vykresľovania.Röntgenové zobrazovanie začína, keď je magnet umiestnený približne 30 mm nad vzorkou a snímky sa získavajú rýchlosťou 4 snímky za sekundu.Počas zobrazovania sa magnet priblížil k sklenenej kapilárnej trubici (na vzdialenosť asi 1 mm) a potom sa pohyboval pozdĺž trubice, aby sa vyhodnotil účinok intenzity poľa a polohy.
Zobrazovacia zostava in vitro obsahujúca vzorky MP v sklenených kapilárach v štádiu translácie vzorky xy.Dráha röntgenového lúča je označená červenou bodkovanou čiarou.
Akonáhle bola stanovená viditeľnosť MPs in vitro, ich podskupina sa testovala in vivo na samičkách potkanov Wistar albino divokého typu (staré približne 12 týždňov, približne 200 g).Medetomidín 0,24 mg/kg (Domitor®, Zenoaq, Japonsko), midazolam 3,2 mg/kg (Dormicum®, Astellas Pharma, Japonsko) a butorfanol 4 mg/kg (Vetorphale®, Meiji Seika).Potkany boli anestetizované zmesou Pharma (Japonsko) intraperitoneálnou injekciou.Po anestézii boli pripravení na zobrazenie odstránením srsti okolo priedušnice, zavedením endotracheálnej trubice (ET; 16 Ga intravenózna kanyla, Terumo BCT) a imobilizáciou v polohe na chrbte na na mieru vyrobenej zobrazovacej platni obsahujúcej termotašku. na udržanie telesnej teploty.22. Zobrazovacia platňa sa potom pripojila k vzorke v zobrazovacom boxe pod miernym uhlom, aby sa trachea zarovnala horizontálne na röntgenovom obrázku, ako je znázornené na obrázku 2a.
(a) Nastavenie zobrazovania in vivo v zobrazovacej jednotke SPring-8, dráha röntgenového lúča označená červenou bodkovanou čiarou.(b, c) Lokalizácia tracheálneho magnetu bola vykonaná na diaľku pomocou dvoch ortogonálne namontovaných IP kamier.Na ľavej strane obrazu na obrazovke môžete vidieť drôtenú slučku, ktorá drží hlavu a zavádzaciu kanylu nainštalovanú vo vnútri trubice ET.
Diaľkovo ovládaný injekčný pumpový systém (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) s použitím 100 ul sklenenej injekčnej striekačky bol pripojený k PE10 hadici (0,61 mm OD, 0,28 mm ID) pomocou 30 Ga ihly.Označte hadičku, aby ste sa uistili, že hrot je v správnej polohe v priedušnici pri zavádzaní endotracheálnej trubice.Pomocou mikropumpy sa odstránil piest injekčnej striekačky a koniec skúmavky sa ponoril do MP vzorky, ktorá sa má dodať.Naplnená zavádzacia trubica sa potom vložila do endotracheálnej trubice, pričom špička sa umiestnila na najsilnejšiu časť nášho očakávaného aplikovaného magnetického poľa.Získavanie obrazu bolo riadené pomocou detektora dychu pripojeného k nášmu časovaciemu boxu založenému na Arduine a všetky signály (napr. teplota, dýchanie, otvorenie/zatvorenie uzávierky a získavanie obrazu) boli zaznamenané pomocou Powerlab a LabChart (AD Instruments, Sydney, Austrália). 22 Pri zobrazovaní Keď kryt nebol k dispozícii, dve IP kamery (Panasonic BB-SC382) boli umiestnené voči sebe v približne 90° uhle a používali sa na kontrolu polohy magnetu vzhľadom na priedušnicu počas zobrazovania (obrázok 2b, c).Aby sa minimalizovali pohybové artefakty, počas terminálnej plošiny respiračného prietoku sa získal jeden obraz na dych.
Magnet je pripevnený k druhému stupňu, ktorý môže byť umiestnený vzdialene na vonkajšej strane zobrazovacieho telesa.Testovali sa rôzne polohy a konfigurácie magnetu, vrátane: umiestneného pod uhlom približne 30° nad priedušnicou (konfigurácie sú znázornené na obrázkoch 2a a 3a);jeden magnet nad zvieraťom a druhý pod ním, s pólmi nastavenými na priťahovanie (obrázok 3b)., jeden magnet nad zvieraťom a jeden pod, s pólmi nastavenými na odpudzovanie (obrázok 3c) a jeden magnet nad a kolmo na priedušnicu (obrázok 3d).Po nastavení zvieraťa a magnetu a naložení testovaného MP do pumpy injekčnej striekačky podajte dávku 50 ul rýchlosťou 4 ul/s po získaní snímok.Magnet sa potom pohybuje tam a späť pozdĺž alebo cez priedušnicu, pričom pokračuje v získavaní obrázkov.
Konfigurácia magnetu na zobrazovanie in vivo (a) jeden magnet nad priedušnicou pod uhlom približne 30°, (b) dva magnety nakonfigurované na priťahovanie, (c) dva magnety nakonfigurované na odpudzovanie, (d) jeden magnet nad priedušnicou a kolmo na ňu priedušnice.Pozorovateľ sa pozrel dolu z úst do pľúc cez priedušnicu a röntgenový lúč prešiel cez ľavú stranu potkana a vyšiel z pravej strany.Magnet sa pohybuje buď po dĺžke dýchacích ciest alebo vľavo a vpravo nad priedušnicou v smere lúča röntgenového žiarenia.
Tiež sme sa snažili určiť viditeľnosť a správanie častíc v dýchacích cestách pri absencii miešania dýchania a srdcovej frekvencie.Preto boli na konci zobrazovacieho obdobia zvieratá humánne usmrtené v dôsledku predávkovania pentobarbitalom (Somnopentyl, Pitman-Moore, Washington Crossing, USA; ~65 mg/kg ip).Niektoré zvieratá boli ponechané na zobrazovacej platforme a po zastavení dýchania a srdcového tepu sa zobrazovací proces opakoval a pridala sa ďalšia dávka MP, ak na povrchu dýchacích ciest nebol viditeľný žiadny MP.
Výsledné obrázky boli korigované na ploché a tmavé pole a potom zostavené do filmu (20 snímok za sekundu; 15–25 × normálna rýchlosť v závislosti od frekvencie dýchania) pomocou vlastného skriptu napísaného v MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Všetky štúdie o dodávke génového vektora LV sa uskutočnili na University of Adelaide Laboratory Animal Research Center a ich cieľom bolo použiť výsledky experimentu SPring-8 na posúdenie, či dodanie LV-MP v prítomnosti magnetického poľa môže zvýšiť prenos génov in vivo. .Na vyhodnotenie účinkov MF a magnetického poľa boli liečené dve skupiny zvierat: jednej skupine bola injekčne podaná LV MF s umiestnením magnetu a druhej skupine bola injekčne podaná kontrolná skupina LV MF bez magnetu.
LV génové vektory boli vytvorené použitím skôr opísaných metód25,26.LacZ vektor exprimuje v jadre lokalizovaný beta-galaktozidázový gén riadený konštitutívnym promótorom MPSV (LV-LacZ), ktorý produkuje modrý reakčný produkt v transdukovaných bunkách, viditeľný na frontoch a rezoch pľúcneho tkaniva.Titrácia sa uskutočňovala v bunkových kultúrach manuálnym spočítaním počtu LacZ-pozitívnych buniek pomocou hemocytometra na výpočet titra v TU/ml.Nosiče sa kryokonzervujú pri -80 °C, pred použitím sa rozmrazia a naviažu na CombiMag zmiešaním 1:1 a inkubáciou na ľade aspoň 30 minút pred dodaním.
Normálne potkany Sprague Dawley (n = 3/skupina, ~2-3 anestetizované ip zmesou 0,4 mg/kg medetomidínu (Domitor, Ilium, Austrália) a 60 mg/kg ketamínu (Ilium, Austrália) vo veku 1 mesiac) ip ) injekcia a nechirurgická perorálna kanyla s 16 Ga intravenóznou kanylou.Aby sa zaistilo, že tkanivo tracheálnych dýchacích ciest dostane transdukciu ĽK, bolo kondicionované pomocou nášho predtým opísaného protokolu mechanických porúch, v ktorom sa povrch tracheálnych dýchacích ciest axiálne trel drôteným košom (N-Circle, nitinolový extraktor kameňov bez špičky NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, USA) 30 p28.Potom, asi 10 minút po perturbácii v kabinete biologickej bezpečnosti, sa uskutočnilo tracheálne podanie LV-MP.
Magnetické pole použité v tomto experimente bolo konfigurované podobne ako pri röntgenovej štúdii in vivo, pričom rovnaké magnety boli držané nad priedušnicou pomocou svoriek destilačného stentu (obrázok 4).Objem 50 ul (2 x 25 ul alikvóty) LV-MP bol dodaný do priedušnice (n = 3 zvieratá) pomocou pipety zakončenej gélom, ako bolo opísané vyššie.Kontrolná skupina (n = 3 zvieratá) dostala rovnaký LV-MP bez použitia magnetu.Po dokončení infúzie sa kanyla vyberie z endotracheálnej trubice a zviera sa extubuje.Magnet zostane na mieste 10 minút pred odstránením.Potkanom bola subkutánne podaná dávka meloxikamu (1 ml/kg) (Ilium, Austrália), po čom nasledovalo stiahnutie anestézie intraperitoneálnou injekciou 1 mg/kg atipamazol hydrochloridu (Antisedan, Zoetis, Austrália).Potkany sa udržiavali v teple a pozorovali sa až do úplného zotavenia z anestézie.
Podávacie zariadenie LV-MP v biologickej bezpečnostnej skrini.Môžete vidieť, že svetlosivá manžeta Luer-lock trubice ET vyčnieva z úst a hrot gélovej pipety zobrazený na obrázku je vložený cez trubicu ET do požadovanej hĺbky do priedušnice.
Jeden týždeň po procedúre podávania LV-MP boli zvieratá humánne usmrtené inhaláciou 100 % C02 a expresia LacZ bola hodnotená pomocou našej štandardnej liečby X-gal.Tri najkaudálnejší chrupkové krúžky boli odstránené, aby sa zabezpečilo, že akékoľvek mechanické poškodenie alebo zadržiavanie tekutín v dôsledku umiestnenia endotracheálnej trubice nebude zahrnuté do analýzy.Každá priedušnica sa pozdĺžne rozrezala, aby sa získali dve polovice na analýzu, a umiestnila sa do pohára obsahujúceho silikónovú gumu (Sylgard, Dow Inc) pomocou ihly Minutien (Fine Science Tools) na vizualizáciu luminálneho povrchu.Distribúcia a charakter transdukovaných buniek boli potvrdené čelnou fotografiou pomocou mikroskopu Nikon (SMZ1500) s kamerou DigiLite a softvérom TCapture (Tucsen Photonics, Čína).Snímky boli získané pri 20-násobnom zväčšení (vrátane maximálneho nastavenia pre celú šírku priedušnice), pričom celá dĺžka priedušnice bola zobrazená krok za krokom, čo poskytovalo dostatočné prekrytie medzi jednotlivými snímkami, aby bolo možné snímky „zošiť“.Obrazy z každej priedušnice sa potom spojili do jedného kompozitného obrazu pomocou Composite Image Editor verzie 2.0.3 (Microsoft Research) s použitím algoritmu planárneho pohybu. Oblasť expresie LacZ v tracheálnych kompozitných obrazoch z každého zvieraťa sa kvantifikovala pomocou automatického skriptu MATLAB (R2020a, MathWorks), ako už bolo opísané28, s použitím nastavení 0,35 < Hue < 0,58, Saturation > 0,15 a Value < 0,7. Oblasť expresie LacZ v tracheálnych kompozitných obrázkoch z každého zvieraťa sa kvantifikovala pomocou automatického skriptu MATLAB (R2020a, MathWorks), ako už bolo opísané28, s použitím nastavení 0,35 < Hue < 0,58, Saturation > 0,15 a Value < 0,7. Площадь экспрессии LacZ в составных изображениях трахеи от каждого животного была количественно определена с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее28, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0 ,7. Oblasť expresie LacZ v kompozitných tracheálnych obrázkoch z každého zvieraťa bola kvantifikovaná pomocou automatického skriptu MATLAB (R2020a, MathWorks), ako už bolo opísané28 s použitím nastavení 0,350,15 a hodnota <0,7.如 前所 述 ， 自动 自动 MATLAB 脚本 （R2020A ， MATHWORKS） 对 来自 每 动物 气管 复合 图像 中 的 LACZ 表达 区域 进行 量化 ， ， 使用 0,35 <如 前所 ， 自动 自动 自动 MATLAB 脚本 （（R2020A ， MATHWORKS） 来自 每 的 复合 图像 的 的 的 表达 量化 ， ， 使用 使用 使用 使用 0,35 < .................... BEDRO Области экспрессии LacZ на составных изображениях трахеи каждого животного количественно определяли с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0,7 . Oblasti expresie LacZ na kompozitných obrázkoch priedušnice každého zvieraťa sa kvantifikovali pomocou automatického skriptu MATLAB (R2020a, MathWorks), ako bolo opísané vyššie, s použitím nastavení 0, 35 < odtieň < 0, 58, saturácia > 0, 15 a hodnota < 0, 7.Sledovaním obrysov tkaniva v GIMP v2.10.24 bola pre každý zložený obrázok manuálne vytvorená maska ​​na identifikáciu oblasti tkaniva a zabránenie akýmkoľvek falošným detekciám mimo tracheálneho tkaniva.Zafarbené plochy zo všetkých zložených obrázkov od každého zvieraťa sa spočítali, aby sa získala celková zafarbená plocha pre toto zviera.Natretá plocha sa potom vydelila celkovou plochou masky, aby sa získala normalizovaná plocha.
Každá priedušnica sa zaliala do parafínu a narezala na hrúbku 5 um.Rezy sa kontrastne farbili neutrálnou rýchlou červenou počas 5 minút a snímky sa získali pomocou mikroskopu Nikon Eclipse E400, kamery DS-Fi3 a softvéru na zachytávanie prvkov NIS (verzia 5.20.00).
Všetky štatistické analýzy sa uskutočnili v GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.).Štatistická významnosť bola stanovená na p < 0,05.Normalita sa testovala pomocou Shapiro-Wilkovho testu a rozdiely vo farbení LacZ sa hodnotili pomocou nepárového t-testu.
Šesť MP opísaných v tabuľke 1 sa skúmalo pomocou PCXI a viditeľnosť je opísaná v tabuľke 2. Dva polystyrénové MP (MP1 a MP2; 18 µm a 0,25 µm, v tomto poradí) neboli viditeľné pomocou PCXI, ale zvyšné vzorky bolo možné identifikovať (príklady sú uvedené na obrázku 5).MP3 a MP4 sú slabo viditeľné (10-15 % Fe3O4; 0,25 um a 0,9 um, v tomto poradí).Hoci MP5 (98 % Fe3O4; 0,25 µm) obsahoval niektoré z najmenších testovaných častíc, bol najvýraznejší.Produkt CombiMag MP6 je ťažké rozlíšiť.Vo všetkých prípadoch sa naša schopnosť detegovať MF výrazne zlepšila pohybom magnetu tam a späť rovnobežne s kapilárou.Keď sa magnety vzdialili od kapiláry, častice sa vytiahli v dlhých reťazcoch, ale keď sa magnety priblížili a sila magnetického poľa sa zvýšila, reťazce častíc sa skracovali, keď častice migrovali smerom k hornému povrchu kapiláry (pozri doplnkové video S1 : MP4), zvýšenie hustoty častíc na povrchu.Naopak, keď je magnet odstránený z kapiláry, intenzita poľa klesá a MP sa preskupujú do dlhých reťazcov siahajúcich z horného povrchu kapiláry (pozri doplnkové video S2: MP4).Keď sa magnet zastaví, častice sa pohybujú ešte nejaký čas po dosiahnutí rovnovážnej polohy.Keď sa MP pohybuje smerom k hornému povrchu kapiláry a od neho, magnetické častice majú tendenciu ťahať nečistoty cez kvapalinu.
Viditeľnosť MP pod PCXI sa medzi vzorkami značne líši.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 a (d) MP6.Všetky tu zobrazené obrázky boli urobené magnetom umiestneným približne 10 mm priamo nad kapilárou.Zjavne veľké kruhy sú vzduchové bubliny zachytené v kapilárach, ktoré jasne ukazujú čiernobiele okrajové rysy obrazu fázového kontrastu.Červený rámček označuje zväčšenie, ktoré zvyšuje kontrast.Upozorňujeme, že priemery magnetických obvodov na všetkých obrázkoch nie sú v mierke a sú približne 100-krát väčšie, ako je znázornené.
Keď sa magnet pohybuje doľava a doprava pozdĺž hornej časti kapiláry, uhol MP reťazca sa mení tak, aby bol zarovnaný s magnetom (pozri obrázok 6), čím sa vymedzujú siločiary magnetického poľa.Pre MP3-5, keď tetiva dosiahne prahový uhol, častice sa ťahajú pozdĺž horného povrchu kapiláry.To často vedie k zhlukovaniu MP do väčších skupín v blízkosti miesta, kde je magnetické pole najsilnejšie (pozri doplnkové video S3: MP5).Toto je tiež obzvlášť zrejmé pri zobrazovaní blízko konca kapiláry, čo spôsobuje agregáciu a koncentráciu MP na rozhraní kvapalina-vzduch.Častice v MP6, ktoré bolo ťažšie rozlíšiť ako častice v MP3-5, sa neťahali, keď sa magnet pohyboval pozdĺž kapiláry, ale struny MP sa disociovali a častice zostali v zornom poli (pozri doplnkové video S4: MP6).V niektorých prípadoch, keď sa aplikované magnetické pole znížilo posunutím magnetu na veľkú vzdialenosť od miesta zobrazovania, všetky zostávajúce MPs pomaly klesali na spodný povrch trubice gravitáciou a zostali v reťazci (pozri doplnkové video S5: MP3) .
Uhol MP struny sa mení, keď sa magnet pohybuje doprava nad kapilárou.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 a (d) MP6.Červený rámček označuje zväčšenie, ktoré zvyšuje kontrast.Upozorňujeme, že ďalšie videá slúžia na informačné účely, pretože odhaľujú dôležitú štruktúru častíc a dynamické informácie, ktoré nie je možné zobraziť na týchto statických obrázkoch.
Naše testy ukázali, že pomalý pohyb magnetu tam a späť pozdĺž priedušnice uľahčuje vizualizáciu MF v kontexte komplexného pohybu in vivo.Neuskutočnili sa žiadne in vivo testy, pretože polystyrénové guľôčky (MP1 a MP2) neboli v kapiláre viditeľné.Každý zo zostávajúcich štyroch MF bol testovaný in vivo s dlhou osou magnetu umiestnenou nad priedušnicou v uhle asi 30° k vertikále (pozri obrázky 2b a 3a), pretože to viedlo k dlhším reťazcom MF a bolo efektívnejšie než magnet..konfigurácia ukončená.MP3, MP4 a MP6 neboli nájdené v priedušnici žiadneho živého zvieraťa.Pri vizualizácii dýchacieho traktu potkanov po humánnom usmrtení zvierat zostali častice neviditeľné, aj keď sa pridal ďalší objem pomocou injekčnej pumpy.MP5 mal najvyšší obsah oxidu železa a bol jedinou viditeľnou časticou, takže sa použil na vyhodnotenie a charakterizáciu správania MP in vivo.
Umiestnenie magnetu nad priedušnicu počas zavádzania MF viedlo k tomu, že mnohé, ale nie všetky, MF boli sústredené v zornom poli.Tracheálny vstup častíc sa najlepšie pozoruje u humánne usmrtených zvierat.Obrázok 7 a doplnkové video S6: MP5 ukazuje rýchle magnetické zachytenie a zarovnanie častíc na povrchu ventrálnej priedušnice, čo naznačuje, že MP môžu byť zacielené na požadované oblasti priedušnice.Pri hľadaní vzdialenejšieho pozdĺž priedušnice po podaní MF sa niektoré MF našli bližšie ku karine, čo naznačuje nedostatočnú silu magnetického poľa na zhromaždenie a zadržanie všetkých MF, pretože boli dodané cez oblasť maximálnej intenzity magnetického poľa počas podávania tekutiny.proces.Postnatálne koncentrácie MP však boli vyššie okolo oblasti snímky, čo naznačuje, že veľa MP zostalo v oblastiach dýchacích ciest, kde bola sila aplikovaného magnetického poľa najvyššia.
Obrázky (a) pred a (b) po podaní MP5 do priedušnice nedávno usmrtenej krysy s magnetom umiestneným tesne nad zobrazovacou oblasťou.Zobrazená oblasť sa nachádza medzi dvoma chrupavkovými prstencami.Pred podaním MP je v dýchacích cestách určitá tekutina.Červený rámček označuje zväčšenie, ktoré zvyšuje kontrast.Tieto obrázky sú prevzaté z videa v S6: MP5 Supplementary Video.
Pohyb magnetu pozdĺž priedušnice in vivo viedol k zmene uhla reťazca MP na povrchu dýchacích ciest, podobnej zmene pozorovanej v kapilárach (pozri obrázok 8 a doplnkové video S7: MP5).V našej štúdii sa však MP nemohli ťahať po povrchu živých dýchacích ciest, ako to môžu robiť kapiláry.V niektorých prípadoch sa reťaz MP predlžuje, keď sa magnet pohybuje doľava a doprava.Je zaujímavé, že sme tiež zistili, že reťazec častíc mení hĺbku povrchovej vrstvy tekutiny, keď sa magnet posúva pozdĺžne pozdĺž priedušnice, a rozširuje sa, keď sa magnet pohybuje priamo nad hlavou a reťazec častíc sa otáča do vertikálnej polohy (pozri Doplnkové video S7).: MP5 o 0:09 vpravo dole).Charakteristický pohybový vzor sa zmenil, keď sa magnet pohyboval laterálne cez hornú časť priedušnice (tj vľavo alebo vpravo od zvieraťa, a nie pozdĺž dĺžky priedušnice).Častice boli počas ich pohybu stále jasne viditeľné, ale keď bol magnet odstránený z priedušnice, boli viditeľné konce reťazcov častíc (pozri doplnkové video S8: MP5, počnúc 0:08).To súhlasí s pozorovaným správaním magnetického poľa pri pôsobení aplikovaného magnetického poľa v sklenenej kapiláre.
Ukážkové obrázky zobrazujúce MP5 v priedušnici živého anestetizovaného potkana.(a) Magnet sa používa na získanie obrázkov nad a naľavo od priedušnice, potom (b) po posunutí magnetu doprava.Červený rámček označuje zväčšenie, ktoré zvyšuje kontrast.Tieto obrázky sú z videa v doplnkovom videu S7: MP5.
Keď boli dva póly naladené v severojužnej orientácii nad a pod priedušnicou (tj priťahovanie; obr. 3b), akordy MP sa javili dlhšie a nachádzali sa skôr na bočnej stene priedušnice než na dorzálnom povrchu priedušnice. priedušnice (pozri prílohu).Video S9:MP5).Vysoké koncentrácie častíc na jednom mieste (tj dorzálny povrch priedušnice) sa však nezistili po podaní tekutiny pomocou zariadenia s dvojitým magnetom, čo sa zvyčajne vyskytuje pri zariadení s jedným magnetom.Potom, keď bol jeden magnet nakonfigurovaný tak, aby odpudzoval opačné póly (obrázok 3c), počet častíc viditeľných v zornom poli sa po doručení nezvýšil.Nastavenie oboch konfigurácií magnetov je náročné kvôli vysokej intenzite magnetického poľa, ktoré priťahuje alebo tlačí magnety.Nastavenie sa potom zmenilo na jeden magnet rovnobežný s dýchacími cestami, ale prechádzajúci cez dýchacie cesty pod uhlom 90 stupňov, takže siločiary pretínali stenu priedušnice ortogonálne (obrázok 3d), čo je orientácia určená na určenie možnosti agregácie častíc na bočná stena.byť dodržaný.V tejto konfigurácii však nedošlo k žiadnemu identifikovateľnému pohybu akumulácie MF alebo pohybu magnetu.Na základe všetkých týchto výsledkov bola pre in vivo štúdie nosičov génov zvolená konfigurácia s jedným magnetom a 30-stupňovou orientáciou (obr. 3a).
Keď sa zviera niekoľkokrát zobrazilo bezprostredne po humánnom usmrtení, absencia rušivého pohybu tkaniva znamenala, že v čistom medzichrupavkovom poli bolo možné rozoznať jemnejšie, kratšie časticové čiary, ktoré sa „kývali“ v súlade s translačným pohybom magnetu.jasne vidieť prítomnosť a pohyb častíc MP6.
Titer LV-LacZ bol 1,8 x 108 IU/ml a po zmiešaní 1:1 s CombiMag MP (MP6) sa zvieratám injikovalo 50 ul tracheálnej dávky 9 x 107 IU/ml LV vehikula (tj 4,5 x 106 TU/potkan).).).V týchto štúdiách sme namiesto pohybu magnetu počas pôrodu upevnili magnet do jednej polohy, aby sme určili, či by sa transdukcia LV mohla (a) zlepšiť v porovnaní s vektorovým podaním pri absencii magnetického poľa a (b) či by dýchacie cesty mohli byť sústredený.Bunky sú transdukované v magnetických cieľových oblastiach horných dýchacích ciest.
Nezdalo sa, že by prítomnosť magnetov a použitie CombiMag v kombinácii s LV vektormi nepriaznivo ovplyvnilo zdravie zvierat, rovnako ako náš štandardný protokol na podávanie vektorov LV.Frontálne snímky tracheálnej oblasti vystavenej mechanickej perturbácii (doplnkový obrázok 1) ukázali, že skupina liečená LV-MP mala významne vyššie hladiny transdukcie v prítomnosti magnetu (obr. 9a).V kontrolnej skupine bolo prítomné len malé množstvo modrého zafarbenia LacZ (obrázok 9b).Kvantifikácia X-Gal zafarbených normalizovaných oblastí ukázala, že podávanie LV-MP v prítomnosti magnetického poľa viedlo k približne 6-násobnému zlepšeniu (obr. 9c).
Príklad zložených obrázkov zobrazujúcich tracheálnu transdukciu s LV-MP (a) v prítomnosti magnetického poľa a (b) v neprítomnosti magnetu.(c) Štatisticky významné zlepšenie v normalizovanej oblasti prenosu LacZ v priedušnici s použitím magnetu (*p = 0,029, t-test, n = 3 na skupinu, priemer ± štandardná chyba priemeru).
Neutrálne rýchle červeno zafarbené rezy (príklad znázornený na doplnkovom obrázku 2) naznačili, že bunky zafarbené LacZ boli prítomné v rovnakej vzorke a na rovnakom mieste, ako už bolo uvedené.
Kľúčovou výzvou v génovej terapii dýchacích ciest zostáva presná lokalizácia nosných častíc v oblastiach záujmu a dosiahnutie vysokej úrovne účinnosti transdukcie v mobilných pľúcach za prítomnosti prúdenia vzduchu a aktívneho odstraňovania hlienu.Pre nosiče ĽK určené na liečbu respiračných ochorení pri cystickej fibróze bolo zvýšenie doby zotrvania nosičových častíc vo vodivých dýchacích cestách doteraz nedosiahnuteľným cieľom.Ako zdôraznil Castellani et al., použitie magnetických polí na zvýšenie transdukcie má výhody oproti iným metódam dodávania génov, ako je elektroporácia, pretože môže kombinovať jednoduchosť, hospodárnosť, lokalizované dodávanie, zvýšenú účinnosť a kratší inkubačný čas.a možno aj nižšiu dávku vehikula10.Avšak in vivo ukladanie a správanie magnetických častíc v dýchacích cestách pod vplyvom vonkajších magnetických síl nebolo nikdy opísané a v skutočnosti nebola in vivo preukázaná schopnosť tejto metódy zvýšiť hladiny génovej expresie v intaktných živých dýchacích cestách.
Naše in vitro experimenty na PCXI synchrotróne ukázali, že všetky častice, ktoré sme testovali, s výnimkou MP polystyrénu, boli viditeľné v zobrazovacom nastavení, ktoré sme použili.V prítomnosti magnetického poľa vytvárajú magnetické polia reťazce, ktorých dĺžka súvisí s typom častíc a silou magnetického poľa (teda blízkosťou a pohybom magnetu).Ako je znázornené na obrázku 10, struny, ktoré pozorujeme, sa vytvárajú, keď sa každá jednotlivá častica zmagnetizuje a indukuje svoje vlastné lokálne magnetické pole.Tieto oddelené polia spôsobujú, že sa ďalšie podobné častice zbierajú a spájajú so skupinovými pohybmi strún v dôsledku miestnych síl z miestnych síl priťahovania a odpudzovania iných častíc.
Diagram znázorňujúci (a, b) reťazce častíc tvoriacich sa vnútri kapilár naplnených tekutinou a (c, d) vzduchom naplnenú priedušnicu.Všimnite si, že kapiláry a priedušnica nie sú nakreslené v mierke.Panel (a) obsahuje aj popis MF obsahujúceho častice Fe3O4 usporiadané do reťazcov.
Keď sa magnet presunul cez kapiláru, uhol časticového reťazca dosiahol kritický prah pre MP3-5 obsahujúci Fe3O4, po čom časticový reťazec už nezostával vo svojej pôvodnej polohe, ale pohyboval sa pozdĺž povrchu do novej polohy.magnet.Tento efekt sa pravdepodobne vyskytuje, pretože povrch sklenenej kapiláry je dostatočne hladký, aby umožnil tento pohyb.Zaujímavé je, že MP6 (CombiMag) sa takto nesprával, možno preto, že častice boli menšie, mali iný povlak alebo povrchový náboj alebo vlastná nosná tekutina ovplyvnila ich schopnosť pohybu.Kontrast na obrázku častíc CombiMag je tiež slabší, čo naznačuje, že kvapalina a častice môžu mať rovnakú hustotu, a preto sa nemôžu ľahko pohybovať smerom k sebe.Častice môžu tiež uviaznuť, ak sa magnet pohybuje príliš rýchlo, čo naznačuje, že sila magnetického poľa nemôže vždy prekonať trenie medzi časticami v tekutine, čo naznačuje, že sila magnetického poľa a vzdialenosť medzi magnetom a cieľovou oblasťou by nemali byť rozdielne. prekvapenie.dôležité.Tieto výsledky tiež naznačujú, že hoci magnety dokážu zachytiť veľa mikročastíc prúdiacich cez cieľovú oblasť, je nepravdepodobné, že sa na magnety možno spoľahnúť pri pohybe častíc CombiMag po povrchu priedušnice.Dospeli sme teda k záveru, že štúdie LV MF in vivo by mali používať statické magnetické polia na fyzické zacielenie na špecifické oblasti stromu dýchacích ciest.
Akonáhle sú častice dodané do tela, je ťažké ich identifikovať v kontexte komplexného pohybujúceho sa tkaniva tela, ale ich detekčná schopnosť sa zlepšila horizontálnym pohybom magnetu nad priedušnicou, aby sa „rozvibrovali“ struny MP.Aj keď je možné zobrazovanie v reálnom čase, je ľahšie rozpoznať pohyb častíc po humánnom zabití zvieraťa.Koncentrácie MP boli zvyčajne najvyššie v tomto mieste, keď bol magnet umiestnený nad zobrazovacou oblasťou, hoci niektoré častice sa zvyčajne nachádzali ďalej v priedušnici.Na rozdiel od štúdií in vitro nemôžu byť častice ťahané dole tracheou pohybom magnetu.Toto zistenie je v súlade s tým, ako hlien, ktorý pokrýva povrch priedušnice, zvyčajne spracováva inhalované častice, zachytáva ich v hliene a následne ich odstraňuje prostredníctvom mechanizmu mukociliárneho klírensu.
Predpokladali sme, že použitie magnetov nad a pod priedušnicou na prilákanie (obr. 3b) by mohlo viesť k rovnomernejšiemu magnetickému poľu, a nie k magnetickému poľu, ktoré je vysoko koncentrované v jednom bode, čo môže potenciálne viesť k rovnomernejšej distribúcii častíc..Naša predbežná štúdia však nenašla jasné dôkazy na podporu tejto hypotézy.Podobne nastavenie dvojice magnetov na odpudzovanie (obr. 3c) neviedlo k väčšiemu usadzovaniu častíc v oblasti snímky.Tieto dve zistenia ukazujú, že nastavenie s dvoma magnetmi výrazne nezlepšuje lokálne ovládanie ukazovania MP a že výsledné silné magnetické sily je ťažké vyladiť, čo robí tento prístup menej praktickým.Podobne orientácia magnetu nad a cez priedušnicu (obrázok 3d) tiež nezvýšila počet častíc zostávajúcich v zobrazenej oblasti.Niektoré z týchto alternatívnych konfigurácií nemusia byť úspešné, pretože vedú k zníženiu intenzity magnetického poľa v depozičnej zóne.Konfigurácia jedného magnetu pri 30 stupňoch (obr. 3a) sa teda považuje za najjednoduchšiu a najúčinnejšiu metódu testovania in vivo.
Štúdia LV-MP ukázala, že keď sa LV vektory skombinovali s CombiMag a aplikovali sa po fyzickom narušení v prítomnosti magnetického poľa, hladiny transdukcie sa výrazne zvýšili v priedušnici v porovnaní s kontrolami.Na základe synchrotrónových zobrazovacích štúdií a výsledkov LacZ sa zdá, že magnetické pole je schopné udržať LV v priedušnici a znížiť počet vektorových častíc, ktoré okamžite prenikli hlboko do pľúc.Takéto zlepšenia zacielenia môžu viesť k vyššej účinnosti pri znížení dodaných titrov, necielenej transdukcii, zápalových a imunitných vedľajších účinkov a nákladov na prenos génov.Dôležité je, že podľa výrobcu možno CombiMag použiť v kombinácii s inými metódami prenosu génov, vrátane iných vírusových vektorov (ako je AAV) a nukleových kyselín.